纳米羟磷灰石-脂肪族聚酯酰胺复合材料对成骨细胞的生物学作用

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[摘要]目的研究纳米羟磷灰石-脂肪族聚酯酰胺（nHA-PEA）对成骨细胞的生物学作用。方法以含有nHAPEA的达尔贝科极限必需培养（DMEM）浸提液作用于试验组细胞，DMEM作用于对照组细胞，以甲噻唑四唑氮检测nHA-PEA对成骨细胞生长的影响，流式细胞计数细胞周期的变化，酶联免疫吸附测定细胞碱性磷酸酶（AKP）活性的变化。将细胞和材料联合培养，观察细胞在复合材料上的黏附和生长情况。结果试验组细胞的相对增殖率为92%～107%且无量效关系，试验组与对照组间差异无统计学意义（P>0.05）；试验组和对照组细胞的细胞周期及AKP活性表达相似，组间差异无统计学意义（P>0.05）。成骨细胞直接培养于复合材料上，显现出良好的黏附、铺展和生长行为。结论nHA-PEA对成骨细胞的生长和功能无不良影响，具有骨细胞相容性。

[关键词]纳米羟磷灰石-脂肪族聚酯酰胺；成骨细胞；生物相容性

[中图分类号]R 783.1[文献标志码]A[doi]10.3969/j.issn.1673-5749.2012.01.009

Biological effects of nano-hydroxyapatite-aliphatic polyester-amide composite on the osteoblastsDeng Xia1, Xia Xi2.（1. Dept. of Stomatology, Nuclear of Industry 416 Hospital, Chengdu 610051, China; 2. Dept. of Prosthodontics, The Affiliated Hospital of Stomatology, Chongqing Medical University, Chongqing 400015, China）

[Abstract]ObjectiveTo evaluate the biological effects of nano-hydroxyapatite-aliphatic polyester-amide composite（nHA-PEA）on the osteoblast.MethodsThe Dulbecco minimum essential medium（DMEM）leaching liquor of nHA-PEA was applied to the osteoblasts of the test groups while the DMEM itself was applied to control. The methyl thiazolyl tetrazolium assay, flow cytometry and alkaline phosphatase（AKP）analysis were used to evaluate the changes in cell growth, cell cycle and cell function. Moreover, osteoblasts were cultured on the surface of nHA-PEA composite and the attachment, growth and proliferation of osteoblast were investigated. Results The cultured osteoblasts grew well and showed nomorphological variation. Osteoblasts of different test groups demonstrated relative proliferation rate ranging from 92%～107% without dose-dependent effect（P>0.05）. The cell cycle and AKP activity were similar in test and control groups（P>0.05）. Good cell attachment and proliferation manner were observed on the membranes. ConclusionnHA-PEA has no negative effects on the osteoblast and its osteoblastcompatibility is proved.

[Key words]nano-hydroxyapatite-aliphatic polyester-amide composite；osteoblast；biocompatibility

有机-无机复合生物材料是组织工程学研究的热点[1]，该材料主要用于修复和重建人体的硬组织。纳米羟磷灰石-脂肪族聚酯酰胺（nano-hydroxyapatite-aliphatic polyester -amide composite，nHA-PEA）复合材料由nHA粒子与PEA均匀混合制得，其中羟磷灰石（hydroxyapatite，HA）是人体骨、牙等无机组织的主要成分，PEA及其共聚物是一类新型的生物可降解高分子材料[2]。nHA- PEA复合材料兼具了有机物的韧性和无机物的刚性，具有良好的理化性能。本研究将nHA-PEA复合材料作用于体外培养的成骨细胞，检测其对细胞生长、增殖能力、细胞周期、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）活性的影响，观察细胞在其表面的黏附、铺展形态，评价其对骨细胞的相容性和生物活性。

1材料和方法

1.1主要材料和仪器

达尔贝科极限必需培养液（Dulbecco minimum

essential medium，DMEM）、胰蛋白酶（Gibco公司，美国），新生小牛血清（成都哈里生物工程有限公司），甲噻唑四唑氮（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）试剂（Sigma公司，美国），AKP试剂盒（北京柏定生物工程有限公司）。Sanyomco-17AI二氧化碳孵箱（Sanyo公司，日本），Olympus IX50相差倒置显微镜（Olympus公司，日本），JSM-5900LV型扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM；JEOL公司，日本），可见光高效分析仪/HTS 7000plus多孔板紫外/荧光（PE公司，美国），流式细胞计数（flow cytometry，FCM；Coulter公司，美国），LightCycler检测仪（Roche公司，德国）。1.2浸提液制备

按文献[3]制得4组nHA-PEA复合材料，按其无机和有机成分的质量分数分组，分别为A组0和100%，B组10%和90%，C组20%和80%，D组30%和70%。将4组nHA-PEA复合材料（平均厚度0.5～1 mm）消毒灭菌后，按照国际标准化组织ISO 10993-5医疗器械生物学评价标准所推荐的试样表面积和浸提介质为6 cm2·mL－1的比例[4]，置37℃滤除细菌的培养液中，浸提3～4 d的浸提液备用。

1.3成骨细胞培养和细胞悬液的制备

取生长稳定的第4代SD乳鼠颅骨成骨细胞，经质量分数0.25%的胰酶消化后行细胞计数，用DMEM配制5×104个每毫升的细胞悬液。

1.4甲噻唑四唑氮比色

将200μL密度为5×104个每毫升的细胞悬液加入96孔板，置于体积分数5%的二氧化碳培养箱，37℃培养24 h，细胞贴壁后弃掉原有培养液，将细胞分为试验组（A～D）和对照组（E），试验组每组均分别加入200、100、50μL终质量分数分别为100%、50%和25%的浸提液，形成A1、

A2、A3，B1、B2、B3，C1、C2、C3，D1、D2、D3，

对照组加入原培养液。每日于相差显微镜下观察细胞形态，生长和增殖情况。分别于第1、3、5、7 d各取96孔板1块，每孔加入20μL的MTT，孵育4 h，每孔加入200μL二甲基亚砜，振荡1 min，混匀，570 nm波长下测定各孔吸光度（A），取3孔均值，计算细胞增殖率（proliferation rate，RP）：RP=（A试验组/A对照组）×100%。1.5流式细胞计数

接种对数生长期的成骨细胞1×105个每毫升瓶，细胞贴壁后A～D组弃原培养液加入质量分数均为100%的复合材料浸提液，E组加入新鲜原培养液，标准环境下3 d换液1次，培养7 d，消化、离心并收集沉淀细胞。流式细胞计数DNA荧光强度及散光参数，Multicycle软件分析细胞的周期分布和程序性死亡情况。1.6碱性磷酸酶活性检测

取1×105个每毫升的细胞悬液3 mL加入小号培养瓶，将其置于体积分数5%的二氧化碳培养箱，37℃培养24 h，细胞贴壁后弃掉原有培养液，A～D组均加入质量分数100%的浸提液，E组加入新鲜原培养液，分别于第4天和第7天中止培养，收集80μL细胞悬液，以AKP试剂盒通过HTS 7000plus多孔板高效分析仪行AKP活性测试。

1.7成骨细胞与材料的复合培养

将载有nHA-PEA复合膜的血盖片试样置于6孔板内，环氧乙烷冷消毒，磷酸缓冲盐溶液浸泡清洗3次，每次1 h，DMEM孵育过夜备用。取1×105个每毫升的细胞悬液，分别接种于已准备好的材料上，37℃，体积分数5%的二氧化碳孵箱继续静置培养5 d。分别于第1天和第5天将试样取出，以体积分数10%的多聚甲醛固定，体积分数30%～100%的乙醇梯度脱水，醋酸异戊酯置换乙醇，临界点干燥，表面喷金，SEM下观察。1.8统计学分析

使用单因素方差分析，分析各组总体均数间差别有无统计学意义，在检验数据之前对数据行方差齐性检验。用q检验比较两组间均数的差别。P>0.05为差异无统计学意义。

2结果

2.1细胞生长观察及甲噻唑四唑氮比色结果

显微镜下，不同质量分数的nHA-PEA复合材料浸提液组及对照组细胞培养6 h后均已贴壁，12 h细胞突逐渐舒展，24 h细胞开始铺展，72 h后细胞数目明显增多，排列规则密集，细胞呈梭形、三角形或不规则形，形态分析各试验组与对照组细胞形态相似，显示各组细胞均生长良好。试验组和对照组不同时间的MTT比色结果见表1。试验组间的MTT值及其与其对照组间的差异无统计学意义（P>0.05）；试验组成骨细胞的相对增殖率为92%～107%，不同质量分数的nHA-PEA复合材料浸提液组对成骨细胞的细胞毒性级数为0～

1级（0级：细胞相对增殖率大于等于100%，1级：细胞相对增殖率为90%～99%）[5]，不同质量分数浸提液组间差异无统计学意义（P>0.05）。

3讨论

在生物医学材料的细胞毒性试验方法中，最常用的是材料浸提液培养法和细胞材料直接接触法。本试验综合运用了这两种方法，首先选择浸渍法，具体原因如下。1）对于nHA-PEA复合材料，nHA的生物相容性勿庸置疑；而PEA是新型的人工合成的生物降解型高分子材料，其理化性能和降解性能已有相关研究[6]，但其生物相容性鲜有报道。2）由于直接接触法共同培养时，细胞对材料表面和对培养孔板底部的黏附性有差异，细胞洗脱率的不同会产生干扰而使试验复杂化。事实上，仅需考察nHA-PEA复合材料溶出物的

细胞毒性，就可以达到初步评价其生物相容性的目的，而且以材料的浸提液代替材料本身在材料学的研究中已得到公认。本试验严格按照国际标准化组织ISO 10993-5医疗器械生物学评价标准和要求制备生物医学材料浸提液[4]，以浸提出最大量的滤出物质，考察其对成骨细胞增殖和细胞周期的影响。

MTT比色是常用的细胞增殖能力检测方法，可以对材料的细胞毒性作出可靠的定量评价[5]。本试验在相差倒置显微镜下观察到nHA-PEA复合材料浸提液不影响细胞的生长形态；MTT值在试验组间以及各组与对照组间差异无统计学意义，试验组的细胞增殖率在92%～107%，表明nHA-PEA复合材料浸提液对成骨细胞的生长无不良影响。因此在进一步地对细胞周期和功能进行的分析中，仅选用最高质量分数的nHA-PEA复合材料浸提液作为试验组进行分析比较。在加入HA的试验组，MTT值略高于对照组，但差异无统计学意义且无量效关系。原因可能与其中的钙、磷水平较高有关。

流式细胞计数已广泛应用于肿瘤学、生物化学和免疫学等领域，细胞周期检测已成为生物材料生物相容性评价的一种可靠方法和指标[7]，是常规细胞增殖试验的一项重要补充。近年来，生物材料生物相容性研究进展之一是生物材料的生物功能性评价[8]。生物材料作用于细胞后使其周期改变，从而使其行为和功能发生改变。本试验在MTT比色的基础上进一步使用流式细胞计数，旨在从细胞增殖周期的角度来分析nHA-PEA复合材料浸提液对细胞增殖周期DNA合成的影响，从分子水平上评价材料的细胞毒性。从MTT比色可见，组间、组内不同质量分数的nHA-PEA复合材料浸提液对成骨细胞的增殖和增殖周期影响不大，细胞周期各亚期组成比和程序性死亡率差异亦无统计学意义。B、C、D组处于S期的细胞略多，表明加入HA对细胞增殖有一定促进作用，但不显著，不存在量效关系。此结果与MTT比色结果一致。

除了对细胞增殖的影响，生物材料的细胞相容性还表现在材料对细胞重要功能的影响。AKP是骨形成所必需的酶，是生物矿化和成骨细胞分化成熟的早期标志物[9-10]：其表达代表骨形成状况，表明细胞分化的开始，并随细胞分化的发展而增强；其活性的高低，反映了相应细胞向成骨方向化的趋势。本研究采用酶联法对成骨细胞AKP的表达进行检测，结果显示试验组AKP的表达量与对照组相比较差异无统计学意义，说明nHA-PEA复合材料对成骨细胞的功能酶表达无不良影响，也没有明显的促进作用，不抑制其分化功能。

用浸提液作为试验样品测定复合材料中滤出物质对细胞生长、增殖的影响，仅为预测材料植入体内的潜在危害提供了初步依据，其结果尚有一定的局限性；因此，需在浸渍试验良性结果的基础上再采用直接法将成骨细胞与材料联合培养，以进一步考察材料本体的结构性能对细胞生物学的影响。本研究表明，成骨细胞在复合材料上具有良好的黏附、铺展和增殖行为，即nHA-PEA复合材料具有成骨细胞相容性和良好的细胞相容性等特性。

4参考文献

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