乌藤镇痛胶囊对类风湿关节炎家兔树突状细胞免疫活性的影响

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[摘要] 目的：研究乌藤镇痛胶囊对类风湿关节炎家兔树突状细胞(DC)的影响。方法：分离乌藤镇痛胶囊组（给药组）和非给药组（对照组）血液中单个核细胞(PBMC)，在含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素4(IL-4)的培养条件下制备DC，用流式细胞仪检测DC表面CD86的表达；混合淋巴细胞反应(MLR)检测DC对T淋巴细胞的刺激能力，酶联免疫吸附法(ELISA)测定MLR上清液中细胞因子水平。结果：两组比较，对照组DC表面CD86的表达明显增高，对T淋巴细胞的刺激能力增强， 致炎细胞因子 (IL-1β)分泌增多， 抑炎因子(IL-10)分泌减少。结论：乌藤镇痛胶囊可能是通过抑制树突状细胞激活T细胞的功能，而起到治疗类风湿关节炎的作用。

[关键词] 乌藤镇痛胶囊；大耳兔；类风湿关节炎；树突状细胞；细胞因子

[中图分类号]R593 [文献标识码]B [文章编号]1673-7210（2007）02（b）-115-02

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种常见的以关节组织慢性炎症为主要表现的自身免疫性疾病。病变关节主要表现为炎症细胞浸润、滑膜增生、血管翳形成以及由此引发的软骨和骨质的损伤。抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）提呈自身抗原引起的T细胞异常活化是本病发病机制的中心环节。树突状细胞（dendritic cell，DC）是目前所知体内功能最强的APC，成熟的DC可以刺激T细胞活化，从而使RA疾病发展，在RA的发病中有举足轻重的作用。乌藤镇痛胶囊由青风藤、制川乌、制草乌、独活、红花等中药组成，具有抗炎、镇痛、免疫抑制等药理作用，在治疗风湿、RA方面，该药已经在临床应用多年，具有较明显的疗效。通过以往的实验证明，本品可抑制体内IL-1β和TNF-α细胞因子的分泌，从而抑制免疫反应，减轻炎症损伤。本实验就乌藤镇痛胶囊对RA家兔体外培养的DC影响进行探讨。

1 材料与方法

1.1 动物

取大耳兔16只，兔龄10～12个月，性，体重3.5～4.0 kg。购自陕西省实验动物中心。

1.2 材料

RPMI 1640(L-glutamine)培养基、 胎牛血清(FCS)购自Gibco公司；淋巴细胞分离液购自天津TBD研究所；溴化-3（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑(MTT)、二甲亚砜(DMSO)购自广州威佳公司；重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白介素-4 (rhIL-4)购自Peprotech公司； PE标记的鼠抗人CD86(B7-2)单抗购自Biolegend公司；白细胞介素-1β(IL-1β)、白介素-10(IL-10)ELISA试剂盒购自美晶公司；流式细胞仪（德国PARTEC公司）。酶联免疫检测仪（华东电子集团医疗装备有限责任公司）。

1.3 方法

1.3.1 大耳兔类风湿关节炎模型的建立弗氏完全佐剂的制备：取无水羊毛脂4份，加热溶化后置于研钵中，稍冷却，边研边加入液体石蜡6份，高压灭菌。再按5 mg/ml加入灭活的卡介苗混合均匀，置于4℃冰箱保存备用。使用前将经硫酸钠3次重结晶的卵白蛋白充分乳化于弗氏完全佐剂中[1]，每周给两组大耳兔皮内1次注射1 ml，共4次。最后一次注射第9天，背部剪毛，第10天在背部皮内注射1％卵白蛋白，每个点注射量为0.2 ml，共注射10个点。在右足垫部注射乳化完全佐剂1 ml，诱导关节炎发生。

1.3.2 分组及给药方法将致炎后的大耳兔随机分成给药组和对照组，每组8只。对照组给生理盐水10 ml/kg，给药组给乌藤镇痛胶囊（本院中药制剂中心提供，批号：060918），按1.0 g/kg，用生理盐水调成混悬剂，灌胃给药，1次/d，连续给药15 d。

1.3.3 DC制备末次给药1.5 h后从兔心脏抽取血液20 ml，注入淋巴细胞分离液中离心(2 000 r/min，20 min)，收集单个核细胞(PBMC)，PBS冲洗2次，RPMI 1640冲洗1次，用完全RPMI 1640(含10%FCS)在6孔培养板中培养2 h(37℃，5% CO2)，去掉非贴壁细胞。贴壁细胞用完全RPMI 1640(含10%FCS、rhGM-CSF 100 ng/ml、rhIL-4 500 U/ml)培养液，置37℃、5%CO2温箱中培养7 d，隔天半量换液1次。收集培养第7天的悬浮细胞即DC进行实验。

1.3.4 DC形态于培养第1、3、5、7天在倒置显微镜下观察DC形态。

1.3.5 流式细胞学分析收集DC细胞，用PE标记的CD86(B7-2)单抗标记细胞，用流式细胞仪检测。

1.3.6 同种异体的混合淋巴细胞反应（MLR）反应中淋巴细胞来自另一组大耳兔的PBMC，经T细胞尼龙毛柱分离后，得到纯的T淋巴细胞。浓度为2×10５/ml的T淋巴细胞与浓度为2×10４/ml的DC各100 μl在96孔平底培养板中37℃、5% CO2条件下混合培养，第4天吸取上清液-20℃保存待测细胞因子，沉淀细胞加MTT液(25 μl/孔)，继续培养4 h后每孔加DMSO 100 μl，培养结束后在波长490 nm处测定吸光值，并计算刺激指数（SI）。结果以3孔均值表示。

1.3.7 细胞因子测定酶联免疫吸附法(ELISA法)分别检测两组混合淋巴细胞反应上清液的IL-1β和IL-10浓度，操作严格按试剂盒说明进行。

1.4 统计学方法

应用SPSS 10.0软件系统分析，所有资料采用均数±标准差(x±s)表示，组间差异用t检验。

2 结果

2.1 DC形态学特点

光学显微镜下可见细胞表面伸出树根样结构，长短不一，呈簇状生长，为典型的DC细胞。对照组和给药组DC在形态上无差别。

2.2 两组DC的功能

对照组DC表面CD86表达明显高于给药组（P＜0.01）（表1）。

表1两组DC表面分子比较 （n=8，x±s)

2.3 两组DC刺激同种异体T细胞增殖能力的分析

结果显示，对照组DC和给药组DC均能刺激同种异体T细胞强烈增殖，且随DC数目的增多而增强；而且对照组家兔DC比给药组家兔DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力明显增强（P

表2给药组和对照组DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力的比较（x±s）

2.4 两组细胞因子测定

对照组MLR上清液中促炎细胞因子IL-1β显著高于给药组，而抑炎细胞因子IL-10低于给药组（表3）。

表3MLR上清液中细胞因子浓度(ng/ml，n=8，x±s)

3 讨论

RA是一种慢性进行性自身免疫性疾病，以关节滑膜增生、血管翳生成及对称性、破坏性的关节病变为主要特征。目前认为，DC是体内功能最强大的APC，成熟的DC表面高表达主要组织相容性复合物Ⅱ类分子与T细胞表面受体结合，为T细胞提供抗原信号。 RA家兔模型血液中CD86分子表达增加，说明CD86＋细胞参与了RA的发病过程。由实验结果看，两组DC表面分子比较有显著性差异(P＜0.01)，说明乌藤镇痛胶囊可抑制CD86分子的表达。既往研究认为，乌藤镇痛胶囊治疗RA药理机制可能与通过影响钙离子依赖的T细胞活化信号传导途径，从而显著降低T细胞内细胞因子TNF－α、IL－1β的表达有关[2]。笔者的研究结果显示，乌藤镇痛胶囊可有效抑制DC中CD86基因的表达，提示乌藤镇痛胶囊可减少DC表面协同刺激分子的表达，在一定程度上阻断了APC对 T细胞的协同刺激作用，达到阻止T细胞异常活化的功能。由表3可见，乌藤镇痛胶囊可下调促炎细胞因子IL－1β的分泌，与对照组比较有显著性差异(P＜0.01)；促进抑炎细胞因子IL-10的生成，与对照组比较有显著性差异(P＜0.05)。

综上所述，乌藤镇痛胶囊对RA的治疗作用可能与一定程度上阻止了DC介导的抗原提呈和协同刺激信号，从而阻断了T细胞的异常活化有关。但是，APC表面协同刺激分子的种类较多，而且 T细胞异常活化的机制比较复杂，因此，乌藤镇痛胶囊对RA的治疗作用机制还有待进一步研究。在实验过程中发现，大耳兔造模RA反应容易形成，本模型形成方法简单，成功率高，产生的RA反应稳定，适合RA治疗药物的筛选。

[参考文献]

[1]徐叔云，卞如廉，陈修. 药理实验方法学[M].第3版.北京：人民卫生出版社，2002.1 417.

[2]李新田，邱财荣，杨喜民，等.乌藤镇痛胶囊对类风湿性关节炎大鼠血清IL－1β和TNF－α的影响[J].中国医药学刊，2005，3（11）：14-15.

（收稿日期：2006-12-20）

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