海芋叶枯病病原菌鉴定

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摘要：2008年以来，在湖北省武汉市的海芋[Alocasia macrorrhiza （Linn.） Schott]叶片上新发生一种叶部病害，由于发病后期叶片干枯撕裂，故称之为叶枯病。海芋叶枯病主要发生在叶片，病斑多从叶缘开始，初期症状是病斑呈水渍状褪绿，后期病斑中央灰白色，边缘褐色，周围有黄色晕圈。从海芋病叶分离得到了病菌，经柯赫氏法则验证为致病病原菌。据病原菌的培养性状及形态特征将该病原菌鉴定为海芋链格孢。病原的确定将为海芋叶枯病发生规律的研究和控制奠定基础。

关键词：海芋[Alocasia macrorrhiza （Linn.） Schott]；叶枯病；病原鉴定；海芋链格孢（Alternaria alocasiae）

中图分类号：S435.121.4+8 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）03-0580-03

海芋[Alocasia macrorrhiza（Linn.）Schott]又名滴水观音，属天南星科（Araceae）海芋属（Alocasia）多年生常绿大型草本植物。茎粗壮，高可达3 m，叶片盾形，肥大翠绿，株态优美，佛焰苞淡绿色至乳白色，下部绿色，花期夏季。海芋喜好温暖、湿润和半阴环境，生命力旺盛，适应性强，适合用大盆栽植，用来布置会议室、大客厅等，也可栽植在池边、假山旁较阴蔽处，是优良的大型观叶植物。近年来，海芋深受人们的喜爱而广泛应用于园林景观中[1]。2008年7月至2009年10月，在湖北省武汉市解放公园和月湖公园的海芋叶片上发现一种病害，导致海芋叶片干枯撕裂，严重影响了海芋的观赏价值。为做好该病害的防治工作，对海芋叶枯病原菌进行了分离培养并鉴定，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源

材料从湖北省武汉市解放公园和月湖公园的发病典型的海芋病叶上采集获得。

1.2 症状描述

按常规方法对田间病株出现的症状进行描述与拍摄。

1.3 病原菌的分离和菌种纯化

采用常规组织分离法分离：切取发病典型的病健交界处的海芋叶片，大小为5 mm×5 mm；用70%乙醇消毒5 s；0.1% HgCl2表面消毒30 s；灭菌水冲洗3～4次；无菌操作接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上，25 ℃下恒温培养，进行菌种纯化和转移至斜面保存。

1.4 病原菌致病性的测定

将纯化后产孢的病原菌孢子用无菌水配制成1×106个/mL孢子悬浮液，田间喷洒在海芋健康寄主植株的叶片上，以无菌水作为对照；保湿，观察并记录发病情况。取接种后海芋病叶进行病原菌再分离，根据分离到的病原菌形态特征进行鉴定。

1.5 病原菌形态观察

参照方仲达[2]的方法进行单孢分离，并将单孢接种在PDA培养基上，25 ℃恒温培养箱中培养，观察菌落颜色、形状、大小；将单孢接种到马铃薯胡萝卜培养基（PCA）上，置于培养箱中，光照和黑暗各12 h交替，25 ℃下培养5～7 d，观察病原菌在PCA和自然基质上的分生孢子梗、分生孢子及喙的形态并测量其大小。

2 结果与分析

2.1 症状描述

该病发生在叶片，病斑多从叶缘开始，发病初期叶缘出现褪绿小斑点，随着病斑的扩大，病斑呈现不规则形，中央灰白，边缘褐色，周围有黄色晕圈，发病后期叶片大部分干枯撕裂（图1）。在潮湿环境下，病部中央产生暗褐色的霉层，且正反面均有。

2.2 致病性测定

接种3 d后，用孢子悬浮液接种的叶片均发病，病斑初期为水渍状小点，随着病害的发展，病斑灰白，边缘褐色有黄色晕圈，引起的症状相同，并从病斑上重新分离到相同的病原菌，遵循柯赫式法则。而对照的叶片均不发病。

2.2 病原菌培养性状及形态

在PDA培养基上该菌菌落圆形扩展，致密绒状，边缘为白色，向内为墨绿色，菌落略突起，接种3 d后菌落半径1.5 cm；接种6 d后菌落半径2.5～3.0 cm；接种8 d后菌落半径3.5～4.0 cm。分生孢子梗单生或簇生，浅褐色，直立，直或膝状弯曲，分隔，分枝或不分枝，从菌丝生出或生于简单的子座上，（32.50～65.00 μm）×（3.75～6.25 μm）。分生孢子多数单生，少数短链生（2～4个孢子），孢子链分枝或不分枝。分生孢子倒棍棒形，黄褐色，具横隔膜6～9个，纵、斜隔膜3～6个，横隔膜处缢缩明显，孢身基部钝圆，至顶部渐窄，顶细胞延伸成喙，孢身（37.5～62.5 μm）×（12.0～17.5 μm ），柱状真喙或假喙，色淡，无隔膜或少隔膜，隔膜间距较大，（16.50～50.00 μm）×（2.50～3.75 μm）。根据病原菌培养性状、分生孢子的成链特征和形态及典型的分生孢子特性等，可确定所分离的真菌为半知菌类链格孢属海芋链格孢（Alternaria alocasiae）[3]。

3 小结与讨论

海芋链格孢是张天宇等[4]于1999年报道的生于天南星科植物上的新种，其主模式为海芋，新种模式标本保存在山东农业大学植物病理学标本室（HSAUP）。此次试验的病原菌分离、鉴定及致病力测定结果表明， 海芋链格孢是湖北省武汉地区海芋叶枯病的主要致病菌。

链格孢属级特征醒目而种级特征变异较大，易于鉴定到属而难以鉴定到种。传统的链格孢属真菌分类主要是以分生孢子和产孢结构的形态为根据的，而形态特征受营养基质和温、湿、光、pH等条件的影响而不稳定。此次试验中还采用在PDA培养基上，25 ℃恒温培养下诱导产孢及在PCA培养基上12 h光照和12 h黑暗交替，25 ℃恒温培养，5 d后用灭菌玻片划碎菌导产孢这两种方法。结果表明，这两种方法产孢量小，且分生孢子形态、大小、喙长、纵横隔数、成链特性等与在自然基质上的差异较大。说明培养基质对链格孢分生孢子的形态、大小、喙长、纵横隔数、成链特性等有明显的影响。

此次试验的报道结果是从形态学角度进行鉴定的，随着分子生物学技术在链格孢系统学中的应用[5-7]，采用分子生物学手段对病原菌进行鉴定越来越广泛，但目前形态学特征仍是最简便、快速、经济的分类依据。该病病原的确立为进一步研究该病害的流行及防治技术提供了科学依据。

参考文献：

[1] 周淑荣，包秀芳，郭文场，等.海芋的栽培管理[J].特种经济动植物，2010，13（12）：30-31.

[2] 方中达.植病研究方法（第三版）[M].北京：中国农业出版社，1998.

[3] 张天宇.中国真菌志：链格孢属[M].北京：科学出版社，2003.

[4] 张天宇，张敬泽，高民侠.中国链格孢属的分类研究Ⅲ.生于漆树科、天南星科和五加科植物上的新种与新记录种（英文）[J]. 菌物学报，1999，18（2）：125-129.

[5] ROBERTS R G，REYMOND S T， ANDERSEN B. RAPD fragment pattern analysis and morphological segregation of small-spored alternaria species and species groups[J]. Mycological Research，2000，104（2）：151-160.

[6] 陈伟群，张天宇.长柄链格孢（Alternaria longipes）和链格孢（A. alternate）的RAPDF分析[J].中国烟草学报，1997，3（2）：29-35.

[7] PRYOR B M， GILBERTSON R. Relationship and taxonomic status of Alternaria radicina， A. carotiincultae， and A. petroselini based upon morphological， biological and molecular characteristics[J]. Mycologia，2002，94（1）：49-61.