HPLC—ELSD测定黄芪破壁饮片中黄芪甲苷的含量

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[摘要]目的 建立测定黄芪破壁饮片中黄芪甲苷含量的高效液相-蒸发光散射检测的方法。方法 采用C18柱（5 μm，200 mm×4.6 mm）， 乙腈-水（32∶68）为流动相，流速1.0 mL/min，蒸发光散射检测器漂移管温度80℃，载气流速2.7 mL/min。 结果 该方法回收率99.5%（RSD=2.0%），精密度RSD=1.4%，重复性RSD=2.5%，黄芪甲苷在（1.2913～10.330）μg范围内线性关系良好（r = 0.9998）。 结论 该方法简便快速，可作为黄芪破壁饮片中黄芪甲苷的含量测定方法。

[关键词] 黄芪破壁饮片；黄芪甲苷；hplc-elsd；含量测定

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）17-0095-02

黄芪是一味常用中药材，具有补气升阳、固表止汗、生津养血之功效，用于气虚乏力、食少便溏、气虚水肿等病症。黄芪破壁饮片是一种新型饮片，采用现代超微粉碎技术，将黄芪饮片粉碎成细胞破壁粉体，再经制粒加工成均匀一致的原饮片全成分的均匀干燥颗粒状饮片。本实验比较了不同提取方法对含量测定结果的影响，结果表明本方法可作为黄芪破壁饮片中黄芪甲苷的含量测定方法。

1仪器与试药

仪器： Agilent 1100高效液相色谱仪；检测器：Alltech 蒸发光散射检测器；色谱柱：Ecosil C18（5 μm，200 mm×4.6 mm）、Dikma Diamonsil C18（5 μm，4.6 mm×200 mm）、Wondasil C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）。天平：Precisa XT200A电子天平、Sartorius LA230S电子天平、Sartorius ME235S 电子天平。

试剂：甲醇、氢氧化钾、乙醇、正丁醇、氢氧化钠、氨水等均为分析纯；乙腈为色谱纯；水为超纯水。

黄芪破壁饮片（中山中智中药饮片有限公司，090401等10批）；黄芪甲苷（中国药品生物制品检定所，批号：110781-200613）。

2方法与结果

2.1色谱条件与系统适应性试验

2.1.1流动相的选择 参考《中国药典》2010版一部“黄芪”含量测定项下的流动相，以乙腈-水（32∶68）为流动相，等度洗脱。

2.1.2色谱柱的选择 曾试用Ecosil C18、Merck C18、Thermo ODS Hypersil C18等多种品牌的色谱柱，结果各色谱柱所得待测成分色谱峰峰形好，分离理想。本试验采用Ecosil C18色谱柱。

2.1.3提取方法的选择 提取方法一：取本品约1 g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇40 mL，冷浸过夜，再加甲醇适量，加热回流4 h，提取液回收溶剂并浓缩至干，残渣加水10 mL，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40 mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5 mL使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱（内径1.5 cm，柱高12 cm），以水50 mL洗脱，弃去水液，再用40%乙醇30 mL洗脱，弃去洗脱液，继用70%乙醇80 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得[1]。提取方法二：取本品约1 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，加热回流2 h，放冷，再称定重量，并用甲醇补足重量，滤过，精密量取续滤液25 mL，蒸干，残渣加水20 mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次30 mL，合并正丁醇液，用1%氢氧化钠溶液充分洗涤2次，每次30 mL，弃去碱液，正丁醇液用水洗涤2次，每次30 mL，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得[2]。提取方法三：取本品约1g，精密称定，置锥形瓶中，加入2%氢氧化钾甲醇溶液50 mL，加热回流2 h，放冷，过滤，用少量甲醇洗涤滤渣及容器，合并洗涤液与滤液，蒸干，残渣加水20 mL使溶解，置于分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次25 mL，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水30 mL洗涤，弃去水层，正丁醇液蒸干，用甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。提取方法四：取本品约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇30 mL， 1%氢氧化钠溶液5 mL，加热回流2 h，滤过，滤渣用甲醇适量洗涤，合并滤液减压回收至干， 残渣用甲醇溶解并转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得[3]。

在试验中选用不同的提取方法进行比较，结果表明方法三中黄芪甲苷的峰面积最高，且方法较简便，故供试品溶液的制备方法选择方法三作为提取方法[4]。比较结果见表1。

3方法学验证

3.1加样回收试验

黄芪甲苷对照品回收溶液的制备：精密称定黄芪甲苷对照品（中检所，批号110781～200613）0.01578 g，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为黄芪甲苷对照品溶液（0.6312 mg/mL）。

供试品溶液的制备：取已知含量的黄芪破壁饮片（批号090401）6份，每份0.5 g，精密称定，置100 mL锥形瓶中，分别精密加入黄芪甲苷对照品溶液2.5 mL，按供试品溶液制备方法制备。见表2。

3.2精密度试验

3.2.1仪器精密度试验 精密吸取黄芪甲苷对照品溶液，在相同的色谱条件下连续进样6次，测定黄芪甲苷峰面积，结果RSD%为1.4%，仪器精密度良好。

3.2.2重复性试验 取同一批黄芪破壁饮片（090401），取6份，每份1 g，精密称定，按供试品溶液制备方法制备，测定结果见表3。

3.3线性关系

分别精密吸取0.5165 mg/mL的黄芪甲苷对照品溶液2.5 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL，注入液相色谱仪中，所得线性关系数据（表4）以对照品浓度（μg）的自然对数为横坐标（X），峰面积的自然对数为纵坐标（Y）绘图得直线，回归方程为Y = 1.71212X +6.72130，r = 0.99987，表明黄芪甲苷进样量在（1.2913 ～10.3300）μg范围内呈良好的线性关系。

3.4耐用性考察

3.4.1被测溶液的稳定性 取同一份供试品溶液（090401），分别在0、6、18、24 h注入高效液相色谱仪，记录峰面积，结果表明被测溶液在24 h内稳定，见表5。

3.4.2不同色谱柱的考察 取同一批供试品溶液（090401），采用三条不同牌子的色谱柱进行测定，考察本品在使用不同牌子C18色谱柱时，黄芪甲苷含量测定结果不受结果影响的程度，结果见表6。

3.4.3不同仪器的考察 取同一批供试品溶液（090401），采用不同牌子仪器进行测定，考察本品在使用不同牌子仪器时，黄芪甲苷含量测定结果不受结果影响的程度，结果见表7。

4含量测定

5讨论

破壁饮片作为一种新型饮片受到越来越多的关注，它克服了传统中药饮片粗、大且需煎煮等诸多缺陷，具有质量均匀度高、卫生学标准高、稳定性好、形态美观、应用方便灵活等优点。该新型饮片进入市场以来获得良好的经济效益，今后有望进入医院药房补充部分传统饮片的不足。

黄芪饮片经超微粉碎破壁后，外观形态发生改变，但饮片本身未发生质的改变，其含量测定结果未发现明显变化。

本实验比较了四种提取方法对测定结果的影响，简化了2010版中国药典现行的黄芪药材供试品处理方法。

由于饮片破壁后比表面积增加，理论上黄芪破壁饮片的有效成分较普通饮片溶出速度快，该部分实验有待后续完成。

[参考文献]

[1] 许峰，高华宏. 高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定健天颗粒中黄芪甲苷含量[J]. 中国药业，2011，20（5）：21.

[2] 彭乃焕，陶窕平，冯绍帆. HPLC-ELSD法测定健脾灵糖浆中黄芪甲苷含量[J]. 中国医药指南，2011，24（9）：232.

[3] 张春辉，吴爱英，杨晓云. HPLC-ELSD测定心肌康颗粒中黄芪甲苷的含量[J]. 中国药品标准，2007，8（2）：68.

[4] 潘宏林，张坦，赵云云. 不同提取方法对黄芪药材中黄芪甲苷含量测定的影响[J]. 中药材，2004，27（10）：774.

（收稿日期：2013-04-02）