嗜酸乳杆菌表层蛋白提取方法及影响因素的研究
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摘 要：对嗜酸乳杆菌S层蛋白的提取方法进行了改进，用酸性5mol/L LiC1法，中性5mol/L LiC4法和8mol/L尿素法提取嗜酸乳杆菌的表层蛋白，考马斯亮兰法测蛋白浓度，进行常规SDS－PAGE，用Gel－Pro软件进行数据分析，得出其中酸性5mol/LiC1法提取表层蛋白百分含量最多，分析影响提取条件的因素，设置0、4、室温(25℃)3个温度梯度和10、15、20、25、30min 5个时间梯度，进行常规SDS－PAGE，检测提取表层蛋白的效果，Sephadex G―100柱分离中性5mol/L LiC1法和8mol/L尿素法提取嗜酸乳杆菌的表层蛋白获得S[A]蛋白，酸性5mol/L LiC1法可用于分析各种表层蛋白；中性5mol/L LiC1法和8mol/L尿素法用于提取43kDa的SA蛋白，25℃处理15min得到最大量的表层蛋白。
关键词：嗜酸乳杆菌；S层蛋白；酸性5mol/L LiC1法；中性5mol/L LiC1法；8mol/L尿素法
中图分类号：Q939
文献标识码：A
文章编号：1007-7847(2007)01-0044-04
黏附作为益生菌在肠道上定植并发挥益生作用的第一步至关重要，目前，对益生菌黏附作用的机理的研究集中在益生菌表层蛋白(S层蛋白)与粘液蛋白的相互作用上，益生菌表层蛋白的提取方法纷繁多样，嗜酸乳杆菌S层蛋白与细胞壁作用键是非共价键或离子键，故可利用疏水键破坏剂或电荷捕获剂来提取，早在1979年，Ma－suda K等用高浓度的尿素提取乳杆菌(Lactobacillus brevis)表层蛋白；1980年．MasudaK又尝试了盐酸胍法提取乳杆菌(lactobacillusbrevis)表层蛋白；2004年，Garrote G L使用了高浓度的LiCl提取乳杆菌(Lactobacillus kefir和Lactobacillus parakefir)的表层蛋白获得了较好的效果，由于乳酸菌表面的结构特征有较大差异，所以提取方法也有所不同。
嗜酸乳杆菌作为哺乳动物及人肠道内的主要益生菌群，无论是在保健行业还是在医药行业都有着不可忽视的地位，Egbert Smih等在2000年报道了嗜酸乳杆菌ATCC 4356表层蛋白中SA蛋白的表达，并探讨了相关基因的表达，国内的相关报道较少，本实验对提取表层蛋白的方法与其影响因素进行了研究，找出适于对嗜酸乳杆菌SA蛋白进行提取纯化进而分析的优化方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种
嗜酸乳杆菌(L actobacill us acidophil usATCC4356)购于中国农业微生物菌种保藏中心，冻干管菌种。
1.1.2 MRS液体培养基
蛋白胨10g，酵母提取物5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，吐温80mL，MgSO4・7H2O 0.58g，MnSO4・4H2O 0.2g，K2HPO4 2g，水1000 mL，121℃，1×105 Pa灭菌20min.
1.2 方法
1.2.1 表面蛋白的不同提取方法
1)酸性5mol/L LiC1法
参考1997年Mark等提取表面蛋白的方法并进行改动，过夜厌氧培养物加入到35mL MRS液体培养基中37℃下静置培养，至OD600达到1.0时，6000r/min离心10min收集菌体，上述菌体用PBS洗涤两次，加入0.5mL酸性5mol/LLiC1(pH2.0)，于冰水混合液中作用15min后，10000r/min离心10min收集上清，上清在4℃下对PBS充分透析，然后用PEG在4℃下浓缩后冻存备用。
2)中性5mol/L LiC1法
参考Takahiro等于1995年提取表面蛋白的方法并进行改动，菌体培养及收集同1中操作，收集的菌体(35mL OD600达到1.0的菌液)冻干，每0.1g冻干菌体加入20mL 5mol/L中性LiC1溶液，在37℃振摇3h，4℃下10000r/min离心10min收集上清，上清对PBS充分透析后，4℃下用PEG进行浓缩后冻存备用。
3)8mol/L尿素法
参考Boot等1993年提取表层蛋白的方法并进行改动菌体培养、收集同1中操作，收集的菌体(35mL OD600达到1.0的菌液)冻干，每0.1g冻干菌体加入20mL 8mol/L尿素溶液后，37℃振摇1h，10000r/min离心10min收集上清，上清对PBS充分透析后，4℃下用PEG进行浓缩后冻存备用。
1.2.2 总蛋白浓度的测定
考马斯亮蓝法测定3种方法所得总蛋白的浓度(具体操作按试剂盒说明进行)。
1.2.3 表面蛋白质的SDS-PAGE
将浓缩后(浓缩相同倍数)的表面蛋白加入2×样品处理液煮沸10min，上样10μL进行常规SDS-PAGE(相对分子质量marker上样量为10μL)，分离胶浓度为12.5％，电泳条件为浓缩胶60V，分离胶80V，电泳完毕后对聚丙烯酰胺凝胶进行考马斯亮兰法染色，对比3种提取方法的异同。
1.2.4 处理时间对酸性5mol/L LiC1法所得表层蛋白浓度的影响
0℃时，菌体经酸性5mol/L LiC1处理不同时间段(10、15、20、25、30min)后，上样10μL进行常规SDS-PAG(相对分子质量marker上样量为10μL)，电泳条件同1.2.3，电泳完毕后对聚丙烯酰胺凝胶进行考马斯亮兰法染色，比较时间对表层蛋白浓度的影响。
1.2.5 温度对酸性5mol/L LiC1法所得表层蛋白浓度的影响
在不同的温度下(0、4、25℃)，用酸性5mol/L LiC1处理菌体15min后，上样10μL进行常规SDS-PAGE(相对分子质量marker上样量为10μL)，电泳条件同1.2.3，电泳完毕后对聚丙烯酰胺凝胶进行考马斯亮兰法染色，比较温度对表层蛋白浓度的影响。
1.2.6 Gel-Pro软件分析
2 结果与讨论
2.1 3种方法的所得蛋白浓度和方法的比较
图1显示出酸性5mol/L LiCI法，中性5mol/L LiC1法。8mol/L尿素法3种方法提取的嗜酸乳杆菌表层蛋白的SDS-PAGE结果。
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用考马斯亮兰法测蛋白总浓度，酸性5mol/L LiC1法所得表层蛋白浓度高于其它两种方法，平均浓度为0.9g/L，中性5mol/L LiC1法所得表层蛋白平均浓度为0.7g/L，尿素法所得表层蛋白平均浓度为0.55g/L。
凝胶图经Gel－Pro软件处理，分析SA蛋白的相对含量，其中2>3>4，即酸性5mol/L LiC1法提取的表层蛋白43 kDa的蛋白条带浓度最高，最大OD值为0.11588，是中性5mol/L LiC1法(0.06057)的1.9倍，是8mol/L尿素法(0.05122)的2.26倍，但是3和4道的条带单一，只有SA蛋白，故提取SA蛋白宜用中性5mol/L LiC1法或8mol/L尿素法要对表层蛋白的各种成分进行分析宜用酸性5mol/L LiC1法。
2.2 处理时间对表层蛋白提取的影响
分别用酸性5mol/L LiC1处理菌体蛋白10、15、20、25、30min后进行常规SDS-PAGE，结果见图2。
凝胶图经Gel-Pro软件处理，1－6道SA蛋白条带的量分别为：120、88.1、94.4、93.7、205．2、63.4μg，其中，15min是这种方法的最优处理时间，所得43 kDa的蛋白条带含量最高，明显高于其它处理时间，酸性5mol/L LiC1对嗜酸乳杆菌表层的处理效果具有上弧线的曲线特点，随着时间的延长，从菌体表层处理下越来越多的S层蛋白，达到一个最高值(15min)后，20min时的小相对分子质量条带增多，推测原因是存在蛋白降解；大相对分子质量蛋白的增加，可能是短时间未被LiC1从菌体表层解离下来的相对分子质量较大的蛋白被解离下来造成的，时尖的最高值就是所得SA蛋白条带浓度最大时的处理时间。即15min，
2.3 温度对表层蛋白提取的影响
选取3个不同的温度，从PAGE的结果可看出室温作用15min表层蛋白的提取影响不大，且利于LiC1的作用效果，条带清晰，浓度高于0℃和4℃，故是最佳的处理温度为室温(25℃)，凝胶图经Gel－Pro软件处理，1－4道43kDa的蛋白条带的量分别为120、47.4、66.2、90.8μg，很明显地，室温处理效果是最佳的。
嗜酸乳杆菌表层蛋白主要有两个表达蛋白SA和SB，通常生理状态主要表达SA.SA是将菌体黏附于肠道的主要黏附蛋白，其C端大约123个氨基酸深入到菌体细胞壁，而N端暴露在菌体外通过非共价键黏附在肠道表层，对表层蛋白的提取的研究有利于进一步研究表层蛋白与肠道粘液蛋白的相互作用，进而研究菌体定植于肠道的机理，利于研制益生菌类产品，造福人类。
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