镉通过氧化应激机制诱导LLC―PK1细胞损伤

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[摘要] 目的 探讨镉诱导猪肾近曲小管上皮细胞（LLC-PK1）毒性及氧化应激在其中的作用。 方法 用不同浓度的氯化镉刺激细胞9h和25μmol/L的氯化镉刺激细胞不同时间，采用Formazan 分析细胞存活率反映镉对细胞的损伤程度；以还原型谷胱甘肽（GSH）为靶点，影响GSH浓度的两个试剂BSO和NAC，观察镉诱导细胞损伤中氧化应激的作用。 结果 随着氯化镉染毒时间延长，细胞存活率下降，同样，随着剂量的增加，细胞的存活率逐渐也下降。同时BSO加重镉诱导的细胞损伤，NAC完全抑制镉诱导的细胞损伤。 结论 氯化镉对LLC- PK1细胞具有明显的毒性，细胞损伤是通过氧化应激介导，且与细胞内的谷胱甘肽的水平有着密切关系。

[关键词] 氯化镉；猪肾近曲小管上皮细胞；氧化应激

[中图分类号] R114 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）03-34-03

镉是主要重金属环境污染物，由于其分布广泛和较长的生物半衰期（16～33年），导致容易在体内肝，肾等重要器官蓄积，从而造成重要器官的损伤，如神经退行性病变，肝，肺，肾的功能障碍和血管系统疾病[1-2]。而长期低剂量接触镉主要引起以近曲小管损伤为主要特征的肾脏损害[3]。镉引起肾细胞损伤是具体通过什么机制，尚未完全清楚。本研究选用猪肾近曲小管上皮细胞（LLC-PK1）为实验对象，观察了氯化镉对该细胞的毒性效应，以及诱导llc-pk1细胞损伤中氧化应激所起的作用，为进一步阐明镉诱导肾细胞损伤机制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

小牛血清、消化酶、抗体、N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）、氯化镉、D-L-丁硫氨酸-[R]-亚砜亚胺（BSO）等化学试剂均购买于Sigma公司（Tokyo，Japan）。全自酶联免疫检测仪（Bio-tek，USA），CO2培养箱（Heraeus instruments，Germany）。Olympus IX71型倒置显微镜（Olympus，Hachioji-shi，Tokyo，Japan）。

1.2 细胞培养

猪的肾小管上皮细胞系LLC-PK1购自American Type Culture Collection（Rockville，MD）。培养液选用胎牛血清（DMEM/F12）培养基加5%小牛血清和双抗（青霉素和链霉素各100U/mL），于恒温细胞培养箱（37℃，5% CO2）中培养，待细胞贴壁生长约90%传代，每周传代2～3次。

1.3 Formazan分析

细胞活性用CCK-8（Dojindo Laboratory，Kumamoto，Japan）试剂来检测。CCK-8试剂中含有WST8：化学名称：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲产物（Formazan）。生成的甲物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

剂量时间-效应关系：细胞以1.5×105的密度铺于96孔板中，用DMEM/F12培养基加5%小牛血清，放置于37℃、5% CO2中培养箱中48h后，将培养基换成1%的小牛血清，再用氯化镉刺激。每孔加CdCl2应用液10mmol/L使CdCl2终浓度分别为0、5、15、25、50、75μmol/L，培养9h，并以25μmol/L的终浓度对细胞分别染毒0、1、3、6、9、12h，然后每孔加入10μL CCK-8反应1h，再用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，进行统计分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，实验数据用（）表示。多组均数比较用单因素方差分析，组间多重比较用Dunnett-t检验，以P

2 结果

2.1 氯化镉对LLC-PK1细胞的毒性作用

采用Formazan分析法测定细胞的相对活性。观察指标是细胞的存活率。由表1可见：用CdCl2（25μmol/L）刺激细胞1h与对照组比较，细胞存活率没有差异，3，6，9，12h各组与对照组比较，细胞存活率逐渐下降，差异有统计学意义（P

2.2 镉通过氧化应激介导细胞损伤

研究表明大部分镉诱导细胞损伤是由氧化应激介导的[4-5]，因此，本实验检测镉诱导LLC-PK1细胞的损伤，观察其是否同样受氧化应激调节。用细胞内主要抗氧化剂谷胱甘肽（GSH）作为研究的靶点。结果如表3所示：细胞分成两组，一组对照，一组实验组加50μmol/L CdCl2培养9h后，用BSO（2.5mmol/L）抑制细胞内谷胱甘肽（GSH）浓度，处理后实验组的细胞存活率为17.53%，明显低于对照组，差异有统计学意义（P

3 讨论

镉是主要的工业和环境污染物之一，肾脏是其作用的主要靶器官。本实验通过Formazan分析法测定细胞存活率表明镉对LLC-PK1细胞的毒性效应有良好的剂量-时间效应关系，时间-效应关系可见氯化镉作用细胞9h，已呈现明显的毒性效应，细胞的存活率已下降（63.53%），见表1，随着CdCl2浓度或时间的增加，LLC-PK1细胞的存活率呈明显下降趋势。但5μmol/L CdCl2刺激细胞时，细胞有增殖的现象，这与纪存委等[6]的报道镉对细胞存在Hormesis效应，即在较低浓度时具有刺激细胞生长的作用，而高浓度时则对细胞有抑制作用，的结果一致。结果表明CdCl2对LLC-PK1细胞毒性有良好的剂量-时间效应关系。此结果与任香梅等[7]结果一致。

Gennari等报道，镉可以促进氧自由基的形成[3]和降低细胞内主要抗氧化物质-谷胱甘肽（GSH）的浓度[8]，会造成多种细胞损伤。大多数毒性作用是由氧化应激所介导[9-10]。蓝晖翔等研究表明，氯化镉、氯化汞单独及联合染毒L02细胞可引起显著的DNA损伤。这可能与氧化应激有关[11]。环境污染物，包括工业和日用化工，农药，化肥，重金属和电离辐射，重金属，特别是镉是导致氧化应激的主要因素。本实验检测镉诱导LLC-PK1细胞的损伤，观察其是否同样受氧化应激调节。用细胞内主要抗氧化剂谷胱甘肽（GSH）作为研究的靶点。N-乙酰半胱氨酸（NAC）是抗氧化剂、巯基保护剂，也是一种自由基清除剂，研究也显示，对急性、亚慢性镉染毒大鼠肝、肾损伤具有明显的拮抗和保护作用[12]。本实验结果显示，同样，NAC增加细胞内GSH浓度能明显减轻镉导致的细胞损伤，效果非常明显，BSO降低细胞内GSH浓度可以加重镉导致的细胞损伤（表3），此结果与阳光等[13]研究相同。这说明镉诱导的细胞损伤是通过氧化应激介导，同时与细胞内的谷胱甘肽的水平有着密切关系，但其具体分子机制需要进一步研究。

综上所述，氯化镉对LLC-PK1细胞有明显毒性，具有很好的时间-剂量-效应关系。镉诱导的细胞损伤是通过氧化应激介导，同时与细胞内的谷胱甘肽的水平有着密切关系。本研究结果为今后研究提供理论依据，但镉如何影响细胞内的谷胱甘肽的水平的具体机制需进一步研究。

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（收稿日期：2013-11-06）