人骨髓基质干细胞体外定向诱导分化为成骨细胞

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[摘要] 目的：探讨人骨髓基质干细胞体外定向诱导成骨细胞的培养方法，为应用人骨髓基质干细胞进行骨科细胞治疗提供依据。方法：抽取人骨髓组织，梯度离心后置于含100 ml/L小牛血清的DMEM培养液中，培养24 h换液，待细胞完全贴壁融合长满瓶底后，胰酶消化，传代，换诱导培养基继续培养、扩增。倒置显微镜观察细胞的形态，结合细胞化学染色、免疫组织化学染色进行细胞鉴定，以及采用细胞增殖法(MTT比色试验)分别于1、2、4、6、8 d测细胞OD值，绘制细胞生长曲线。结果：传代细胞4～5 d即可传代，在诱导培养基中2 周形成多层结构，并聚集成黑色结节。培养细胞ALP染色强阳性，Ⅰ型胶原免疫组化染色呈黄褐色，细胞在接种后3～6 d增殖最快。结论：本实验方法应用骨髓基质干细胞体外定向诱导所培养的细胞符合成骨细胞的形态特征和生物学特性。

[关键词] 骨髓基质干细胞；细胞培养；成骨细胞

[中图分类号] R-33 [文献标识码]B [文章编号]1673-7210（2008）01（b）-041-02

近年来，干细胞的体外培养扩增和定向诱导分化取得了较大进展，越来越多的研究证明骨髓基质干细胞可定向地向成骨细胞系转化[1，2]，是骨组织工程中种子细胞的重要来源，同时在临床治疗骨不连、骨缺损等方面具有巨大的应用潜能。

1材料和方法

1.1材料

淋巴细胞分离液、DMEM高糖培养基、胰蛋白酶（Gibco公司）、小牛血清、维生素C、地塞米松及兔抗人Ⅰ型胶原抗体（Sigma公司，美国）、兔抗人Ⅲ型胶原抗体（博士德公司）、ABC免疫组化检测试剂盒、噻唑蓝、二甲基亚砜（Amersco公司）。

1.2 方法

1.2.1人骨髓基质干细胞的培养及诱导分化为成骨细胞参照文献[3～5]，无菌条件下，以含5 ml肝素钠生理盐水(100 U/ml)的20 ml注射器，于骨不连患者（术前检查肝肾功能正常，无代谢性骨病，经患者同意）髂后上棘穿刺抽取骨髓组织5 ml，移入含5 ml肝素钠盐水的螺口试管内，混匀，加入含10 ml Ficoll梯度液的离心管中，进行梯度离心(3 000 r/min×20 min)，吸管吸取单核细胞部分(云雾状层)，以DMEM洗涤两遍(1 000 r/min×5 min)，按1×105 cells/ml细胞数接种于25 ml培养瓶内，加入5 ml含100 ml/L小牛血清的DMEM，在37℃、5%CO2培养箱中培养，24 h换液，清除悬浮细胞，而后隔日换液，观察细胞生长情况。细胞长满培养瓶底80%后，去培养液，加0.25%胰蛋白酶1 ml，轻轻晃动培养皿，使胰蛋白酶覆盖整个皿底，37℃ 消化3 ～5 min，镜下见细胞皱缩，间距加大，分离为单个小圆细胞时，滴加DMEM 培养液中止消化，然后吹打呈细胞悬液，将细胞悬液移入15 ml 离心管，离心10 min，1000 r/min，弃上清，沉淀细胞加含血清DMEM培养液5 ml吹打呈细胞悬液，移入培养瓶在37℃、5% CO2培养箱中培养，传代培养。传代改用含地塞米松和维生素C的诱导培养基进行细胞培养和扩增，诱导培养基组成：含100 ml/L胎牛血清的DMEM高糖培养基加入地塞米松和维生素C，终末浓度分别为10 mol/L和50 ng/L。

1.2.2 人骨髓成骨细胞的鉴定

1.2.2.1 倒置显微镜观察观察细胞的形态结构、生长速度。

1.2.2.2 细胞碱性磷酸酶(ALP)化学染色第3代培养细胞长满后，胰酶消化制成浓度为1×105 cells/ml的细胞悬液，接种于事先放入盖玻片的24孔板内，加入定量含100 ml/L小牛血清的DMEM培养液，培养3 d后取出，4℃生理盐水冲洗，置于冷丙酮中固定15 min，而后用钙钴法染色测定细胞ALP活性，计算阳性细胞百分比。

1.2.2.3 Ⅰ型及Ⅲ型胶原抗体免疫组化染色将1×105 cells/ml的成骨细胞和成纤维细胞悬液接种于24孔板内的盖玻片上，培养3 d后取出，40 g/L多聚甲醛4℃下固定15 min，乙醇脱水后吹干，以兔抗人Ⅰ型及Ⅲ型胶原抗体为一抗，按标准ABC检测试剂盒说明进行免疫组织化学染色。阳性为黄褐色。

1.2.3 细胞增殖检测（MTT比色试验）以0.25％胰蛋白酶消化培养瓶中的第三代贴壁细胞2～3 min，去胰蛋白酶，加含血清DMEM终止消化，把所得细胞悬液配成浓度为1×104 cells/ml。取5块96孔板，每块板5孔各加入细胞悬液200 μl，在37℃、5％CO2培养箱中培养4 h。空白对照孔以200 μl DMEM代替细胞悬液。细胞接种后24 h为零点，接种后1、2、4、6、8 d用MTT比色试验[6]测细胞在支架上的增殖：每次各孔加5 mg/L的MTT 20 μl，37℃培养箱中培养4 h，去孔内液，加0.25％胰蛋白酶消化2～3 min，加DMEM 200 μl终止消化，1 000 r/min离心5 min，弃孔内液，每孔加150 μl DMSO，振荡10 min，在Model 550酶标仪上读取OD值，检测波长为490 nm。绘制细胞的生长曲线。

2 结果

2.1倒置显微镜观察

细胞接种后24 h大部分细胞贴壁，细胞呈梭形，并有积聚，呈团簇生长倾向。4～5 d细胞体积增大，带有粗大突起，并向多角形转化，1周细胞长满瓶底，变为细长的梭形。传代细胞生长明显加快，6～8 h基本贴壁，呈长梭形或大多角形，4～5 d即可传代。改用条件培养液后细胞生长速度明显变慢，1周左右细胞长满，呈现成骨细胞形态（见图1），三角形、多角形，多有伪角，细胞核偏于一侧。2 周后细胞聚集，细胞变长趋向于梭形，可见重叠生长，传代后细胞增殖加快，有黑色结节形成。

2.2细胞碱性磷酸酶染色

ALP阳性细胞胞质呈灰黑色，染色后大部分细胞均呈阳性反应，强阳性细胞多为大多角形，而梭形细胞染色略弱（采用细胞计数法，计算平均阳性细胞百分率为86.5%），见图2。

2.3Ⅰ,Ⅲ型胶原免疫组化染色

经ABC法染色，Ⅰ型胶原抗体染色细胞胞核周围呈黄褐色，而Ⅲ型胶原抗体染色为阴性，见图3。

2.4细胞增殖检测

取第三代人骨髓成骨细胞接种后1、2、4、6、8 d细胞的OD值，绘制细胞生长曲线（图4）。发现人骨髓成骨细胞体外培养在第3～6日生长活跃，增殖迅速，培养第8日后进入细胞增殖稳定期。

3 讨论

骨折愈合的主角是成骨细胞，骨不愈合或延迟愈合的主要原因也是缺乏足够数量的成骨细胞。因此，本实验的设想是利用自体骨髓进行体外诱导分化为成骨细胞，并进行扩增，将扩增的细胞回植骨折处，促进骨折愈合，缩短骨折愈合时间。

体外培养成骨细胞是研究成骨机制的重要手段，且用于临床治疗骨不连、骨缺损的修复具有重要意义。骨髓基质干细胞是具有多向分化潜能的组织干细胞，且具有组织依赖性分化能力，目前在细胞治疗方面十分引人注目[7，8]。以往培养的成骨细胞多取材于人或动物的骨和骨膜组织，利用具有成骨潜能的骨髓组织培养成骨细胞具有取材方便、对供体损伤小和可经皮注射，移植前可以在体外大量稳定扩增[9]，术后无须长期应用免疫抑制剂等优点。

本实验对文献以往的成骨细胞培养方法加以了改进，简化了操作，缩短了细胞培养时间；并在培养基中添加了维生素C和地塞米松，有研究表明维生素C可以促进细胞的分化，地塞米松不仅可以使骨髓基间充质干细胞向成骨细胞分化，还可以促进成骨细胞的增殖和分化[10]。实验结果表明，细胞贴壁时间短，增殖速度快。通过培养细胞形态学观察及成骨细胞具有特征性的鉴定[11]：培养细胞具有较高的碱性磷酸酶活性，能够合成Ⅰ型胶原，而不能合成Ⅲ型胶原，证实所培养的细胞为成骨细胞，结果还表明，骨髓诱导来源的成骨细胞在体外可以稳定传代，增殖速度较快。因此，我们这种利用骨髓在体外进行诱导培养成骨细胞的实验方法是可行的。

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[11]Kassem M，Mosekilde L，Rungby J，et al．Formation of osteoclasts and osteoblasts-like cells in long-term human bone marrow cultures[J]．APMIS，1991，99(3):262-268.

（收稿日期：2007-10-23）

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