PRDX5基因启动子的荧光素酶报告质粒的构建

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摘要：目的 构建含prdx5基因启动子的荧光素酶报告质粒。方法 ①通过生物信息学方法，查询PRDX5基因启动子核酸序列；②使用PCR扩增人PRDX5基因启动子片段，将启动子插入到pGL3-Basic载体中，构建含PRDX5基因启动子片段的荧光素酶报告质粒；③双酶切及测序确定PRDX5基因启动子的荧光素酶报告质粒扩增正确。结果 PCR扩增的PRDX5启动子片段插入到载体中，经测序证实正确。结论 成功构建含PRDX5启动子的荧光素酶报告质粒。

关键词：PRDX5；启动子；荧光素酶报告基因

Construction of Luciferase Reporter Plasmid PRDX5 Gene Promoter

HU Le-lin

(School of Medicine,The Anhui University of Science and Technology,Huainan 232001,Anhui,China)

Abstract：ObjectiveTo construct a pGL3-PRDX5-promoter-Luc plasmid and to vertifying its luciferase activity. Methods①search the nucleic acid sequence of the promoter PRDX5 by bioinformatics analysis.②Methods of PCR was performed to amplify the promoter PRDX5. the promoter PRDX5 was inserted into pGL3-Basic cloning vector to construct luciferase reporter plasmid with the promoter PRDX5.③pGL3-PRDX5-promoter-Luc plasmid was verified by double-enzyme cleavage and sequencing method.ResultspGL3-PRDX5-promoter-Luc plasmid was identified to be correct by double-enzyme cleavage and sequencing method.Conclusion A pGL3-PRDX5-promoter-Luc plasmid was successfully constructed.

Key words：PRDX5;Promoter;Luciferase reporter plasmid;Reactive oxygen species

PRDX5是Peroxiredoxins（PRDXs）过氧化物酶家族蛋白的一种，研究显示在它广泛表达于哺乳动物的各种细胞，定位于细胞质、过氧化物酶体和线粒体中，但在许多细胞中PRDX5主要定位于线粒体，它与组织过氧化物、过氧化亚硝基阴离子有高的亲和力[1]。Masaki shiota[2]等人发现在外源过氧化氢处理或组织缺氧情况下人类前列腺癌PC3细胞PRDX5表达增高。研究还显示人类定位于线粒体的PRDX5能保护线粒体DNA免受过氧化氢的损伤。并且PRDX5能够抑制p53诱导的活性氧簇的产生和细胞凋亡[3]。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1 菌种、质粒和细胞系大肠杆菌tans-5α购自Trans-Gene（全式金）公司；载体质粒pGL3-Basic，由本室保存。

1.1.2 DNA 重组所用工具酶及试剂BglII、MluI 等限制性内切酶，Taq DNA Polymerase，T4 DNA Ligase购自New England Lab和Promega 公司。大提质粒试剂盒购自威格拉斯仪器有限公司。其它常规试剂均为进口分装或国产分析纯。

1.2方法

1.2.1用PCR和酶切的方法得到目的片段利用DNA提取试剂盒在U2OS细胞中提取全基因组细胞作为模板，根据已知PRDX5cDNA序列，由生物信息学方法自UCSC数据库分析其可能的转录起始位点，选择TSS上游约1200bp下游约200bp范围作为其可能的启动子序列进行引物设计。预计扩增片段长度为1400bp。我们使用软件DNAMAN分析其上可能存在的限制性内切酶位点，结合载体质粒pGL3-Basic上的限制性内切酶位点，选择分别在上、下游引物末端，添加BglII、MluI限制性内切酶位点序列。见表1。

1.2.2目的片段与相应载体的连接将扩增好的目的片段和PGL3-basic-Luc进行同样的双酶切鉴定，回收酶切产物，并进行质粒连接反应。在10μl的反应体系中加入载体、插入片段、T4DNA ligase、T4DNA ligase buffer。载体与插入片段的摩尔数之比控制在1：3，且二者的总量控制在300ng~500ng之间，置于4℃冰箱连接16h。目的片段和PGL3-basic-Luc通过BglII、MluI酶切位点连接重组质粒PGL3-PRDX5-promoter-Luc。

1.2.3筛选阳性质粒并测序将连接产物转化E.coli DH5感受态细胞，提取质粒酶切鉴定，酶切正确的质粒送至公司测序确定。

2结果

2.1生物信息学方法预测PRDX5启动子序列根据已知的PRDX5 cDNA序列，在UCSC Genome Bioinformatics（genome.ucsc.edu/）数据库中，预测其可能的转录起始位点。根据预测的转录起始位点，将其上游约1200bp下游约200bp范围作为可能的启动子序列。

2.2 PCR方法扩增预测序列根据预测启动子的序列设计引物，利用DNA提取试剂盒在U2OS细胞中提取全基因组细胞作为模板，用PCR试剂盒扩增出约1.4kb的目的条带。见图1。

图1PCR扩增PRDX5promoter结果

2.3构建pGL3-PRDX5-promoter-Luc荧光素酶报告基因质粒将扩增好的目的片段和PGL3-basic-Luc进行同样的双酶切鉴定，回收酶切产物，并进行质粒连接反应。再将连接产物转化到感受态大肠杆菌中，接种在带氨苄西林的LB固体培养基中，37℃孵育过夜后。挑出阳性克隆，提取质粒并进行酶切鉴定。图2为0.8%的琼脂糖凝胶结果，可看出在相应的大小条带上出现阳性结果。

图2PRDX5启动子片段连接入荧光素酶报告质粒pGL3-Basic酶切鉴定。挑选的克隆扩增后所提质粒进行KpnI、NheI限制性内切酶双酶切。

2.4筛选阳性质粒并测序将连接产物转化E.coli DH5感受态细胞，提取质粒酶切鉴定，酶切正确的质粒送至公司测序确定。

3讨论

PRDX5是Peroxiredoxins过氧化物酶家族蛋白的一种，但在许多细胞中PRDX5主要定位于线粒体。在氧化应激情况下PRDXs家族蛋白能将H2O2转化为水，清除ROS，抵抗ROS对细胞的损害[4]。Yuan Zhou等在哺乳动物细胞中首次证实PRDX5能发挥抗氧化剂功能，抑制p53诱导产生的细胞内ROS。PRDX5的晶体结构研究显示，与PRDXs家族的其它成员相比，PRDX5具有更强的清除ROS的能力。大量研究显示活性氧簇水平与肿瘤的发生密切相关，因此可以推测PRDX5可能与肿瘤的发生相关。如果PRDX5与肿瘤的发生相关，那么研究PRDX5的转录激活将是很有意义的。在本研究中，我们克隆出PRDX5的启动子荧光素酶报告质粒，并检测了其活性。

参考文献：

[1]Banmeyer I, Marchand C, Verhaeghe C, et al. Overexpression of human peroxiredoxin 5 in subcellular compartments of Chinese hamster ovary cells: effects on cytotoxicity and DNA damage caused by peroxides[J]. Free Radic Biol Med,2004,36(1):65-77.

[2]Shiota M, Izumi H, Miyamoto N, et al. Ets regulates peroxiredoxin1 and 5 expressions through their interaction with the high-mobility group protein B1[J]. Cancer Sci,2008,99(10):1950-1959.

[3]Zhou Y, Kok K H, Chun A C, et al. Mouse peroxiredoxin V is a thioredoxin peroxidase that inhibits p53-induced apoptosis[J]. Biochem Biophys Res Commun. 2000, 268(3): 921-927.

[4] Dubuisson M, Vander S D, Clippe A, et al. Human peroxiredoxin 5 is a peroxynitrite reductase[J]. FEBS Lett. 2004, 571(1-3): 161-165.