紫茎泽兰叶第四级提取物治疗鸡球虫病的研究

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摘要：选择健康、体重相近的25日龄铁脚麻鸡30只随机分为3组，第1组不作处理（空白对照组），第2、3组滴喂球虫孢子，3 d后第2组投喂地克珠利，第3组投喂紫茎泽兰（Eupatorium adenophorum）第四级提取物，7 d后试验结束，分别计算药物抗球虫指数，测定小鸡血液丙氨酸氨基转移酶活性。此外，用质谱、红外光谱、核磁共振等测定试验药物分子结构。结果表明，第3组抗球虫指数为188.67，疗效达到高效。试验药物组的丙氨酸氨基转移酶活性平均值为99.88，低于空白对照组的，除肠道外其他器官未见异常症状，说明试验药物具有一定的毒性，但对鸡的毒副作用较小。分子结构测定表明试验药物为含有苯胺和氯的结构复杂的脂类。

关键词：紫茎泽兰（Eupatorium adenophorum）；提取物；治疗；鸡球虫病

中图分类号：S859 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）22-5525-03

鸡球虫病是鸡常见且危害十分严重的寄生虫病，是一种或多种球虫引起的急性流行性寄生虫病。球虫的抗药变异性强，目前所用的抗球虫药物几乎都已出现抗药虫株[1]，如今即使在用药情况下仍可暴发球虫病或出现亚临床感染情况[2，3]，给养鸡业造成很大损失[4-6]。紫茎泽兰（Eupatorium adenophorum）是外来入侵植物，对动植物均有危害，难以防治[7]，已在中国南方地区广泛蔓延[8，9]，对生态系统造成严重破坏[10]，已被国家环保总局列为外来有害物种[11]。为了开发利用紫茎泽兰，本研究用其叶的第四级提取物进行鸡球虫病的治疗试验，探究紫茎泽兰毒素对鸡球虫的抑制能力，既为治疗鸡球虫病寻找新药物，也为紫茎泽兰的利用探索新途径。

1 材料与方法

1.1 材料

紫茎泽兰鲜叶采自野生植株；含球虫卵囊鸡粪采自暴发球虫病的养鸡场；试验动物为25日龄铁脚麻鸡。

主要试剂：异丙醇、石油醚、乙酸乙酯、乙醇、2.5%重铬酸钾溶液、生理盐水、硅胶（200～300目）、抗球虫药物地克珠利、丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒、肝素。

主要仪器：干燥箱、旋转蒸发仪、培养箱、离心机、显微镜、微量移液器、色谱柱管、电子天平、半自动生化分析仪。

1.2 方法

1.2.1 紫茎泽兰第四级提取物的制备 将紫茎泽兰鲜叶置干燥箱内于65 ℃中烘干，粉碎后于试剂瓶中用异丙醇浸泡5 d，过滤，用旋转蒸发仪浓缩滤液。用硅胶柱层析法对浓缩液进行组分分离，各级洗脱液为：石油醚、石油醚︰乙酸乙酯（分5级：3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）、乙酸乙酯、乙酸乙酯∶乙醇（分3级：2∶1、1∶1、1∶2）、乙醇。用旋转蒸发仪把第四级组分的洗脱液蒸发后所得即为紫茎泽兰第四级提取物。

1.2.2 球虫孢子囊的获取 将球虫病患鸡粪便放入清水中搅成悬液后用棉布过滤，滤液经离心（3 000 r/min，10 min）后弃去上清液，加清水把沉淀物搅溶后再离心，重复上述操作3次，弃去上清液后得到球虫卵囊（含多种球虫的）。将球虫卵囊放入2.5%重铬酸钾溶液中于29 ℃中培养5 d，显微镜下观察， 确认卵囊孵化为孢子囊后将培养液离心， 弃去上清液后加清水洗涤离心3次，弃去上清液， 加入适量生理盐水得球虫孢子囊悬液。用微量移液器吸取2 μL该悬液于载玻片上，显微镜下计数孢子囊数量，重复3次，用3次的平均数算出1 mL悬液中孢子囊的数量。

1.2.3 试验分组及处理 25日龄铁脚麻鸡购进后观察2 d，淘汰特小个体，随机分为3组，第1组为空白对照组，第2组为对照药物（地克珠利组），第3组为试验药物组（紫茎泽兰叶第四级提取物组），每组10只，分别称重。给第2、3组试验鸡滴喂球虫孢子，每只的滴喂量为2万～4万个（根据上述计数结果确定悬液滴喂量），空白对照组不作处理。接种球虫3 d后， 取血便于显微镜下检查， 确认各试验组鸡患球虫病后给第2组投喂浓度为0.15 mL/L地克珠利水溶液，剂量按说明书使用，第3组投喂紫茎泽兰第四级提取物，用量为0.5 g/kg拌料使用。试验期间正常管理，投药7 d后将各组鸡分别称重、抽血、屠宰、解剖。

1.2.4 抗球虫效果评判

1）相对增重率。相对增重率（%）=药物试验组的平均增重/空白对照组的平均增重×100

2）存活率。存活率（%）=每组终末存活数/每组初始鸡只数×100

3）病变值。先根据病变的严重程度，用Johnson标准进行病变记分[12]，具体记分方法为：肠道壁无肉眼可见病变者记为0分；肠道壁有少量散在的淤血点、肠道壁不增厚，内容物正常者记为1分；肠道壁有较多的淤血点、肠道内容物明显带血、肠道壁增厚、盲肠内容物正常者记为2分；肠道有较多血液或有盲肠芯（血凝块或灰白色干酪样块状物）、肠道壁明显增厚者记为3分；肠道充满大量血液或盲肠芯很大，致使盲肠肿大或死亡者记为4分。对每只鸡分别记分后算出各组的平均病变记分，再按下式计算每组病变值。

病变值=组内平均病变记分×10

4）平均卵囊值。取1 g肠道内容物于10 mL水中，充分搅拌成悬液后用微量移液器吸取2 μL于载玻片上，显微镜下计数卵囊数量，重复3次，用3次的平均数算出1 g肠道内容物中的卵囊数，按下式算出克卵囊数（Oocyst pergram，OPG）：

克卵囊数=1 g肠道内容物的卵囊数×10-6

当0≤OPG

5）判定标准。用抗球虫指数（Anticoccidial Index，ACI）作为判定药效的指标，按以下方法计算药物的抗球虫指数[12]。

抗球虫指数（ACI）=（相对增重率+存活率）-（病变值+平均卵囊值）

药效判定标准为：ACI≥180者为高效；180> ACI≥160者为中效；160>ACI≥120者为低效；ACI

1.2.5 试验药物毒性测定 以试验鸡血液中丙氨酸氨基转移酶活性的高低（与空白对照组相比）作为药物毒性大小的指标。屠宰前对鸡进行采血，每只采血10 mL，置于盛有肝素的试管中，轻微振荡2 min后离心（2 000 r/min，10 min），取上清液，加入丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定试剂，充分反应后用半自动生化分析仪测定丙氨酸氨基转移酶活性（以吸光度来表示，吸光度越大，活性越大）。此外，通过解剖观察，了解试验鸡各器官组织的病变情况，以此判断试验药物毒性的大小。

1.2.6 试验药物分子结构测定 取试验药物样品进行质谱（MS）、红外光谱（IR）、核磁共振（NMR）H谱和C谱测定，通过测定了解其分子结构。

2 结果与分析

2.1 紫茎泽兰叶第四级提取物的疗效

由表1可知，即使受到球虫的严重感染，第3组的相对增重率仍达91.67%，存活率为100%，这表明紫茎泽兰叶第四级提取物对球虫具有明显的抑制作用。

2.2 紫茎泽兰叶第四级提取物对丙氨酸氨基转移酶活性的影响

各组小鸡血液丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性的测定结果见表2。由表2可知，ALT易被有毒物质破坏，浓度下降，活性降低。第3组ALT活性明显低于第1组，这表明紫茎泽兰叶第四级提取物对试验鸡有一定的毒性。

2.3 试验药物分子结构

试验药物的分子结构是由中国科学院昆明植物所植化分析测试中心进行测定，测定结果见图1。

3 小结与讨论

3.1 紫茎泽兰叶第四级提取物的疗效

从表1可知，第3组的抗球虫指数略高于第2组，疗效达高效，这表明试验药物具有较强的抗球虫作用。从试验过程中试验动物的病情变化来看，投喂药物后的第二天小鸡血便现象消失，这也表明试验药物对鸡球虫有较强的抑制作用。

3.2 紫茎泽兰叶第四级提取物的毒性

由表2可知，第3组的丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性比第1组低35.98%，比第2组低8.84%，从表1可知，第3组的相对增重率小于第2组，但第3组的病变值也小于第2组，说明紫茎泽兰叶第四级提取物对试验鸡的毒副作用比地克珠利大，其抗球虫能力也比地克珠利强。从解剖观察结果来看，紫茎泽兰叶第四级提取物的毒性较小，其毒副作用在试验鸡的耐受范围之内。

3.3 试验药物的分子结构

从图1可知，紫茎泽兰叶第四级提取物为含有苯胺和氯的结构复杂的脂类，因条件所限，本研究未对其抑制球虫的作用机理进行研究，仅测定了其分子结构，该测定结果可为紫茎泽兰进一步开发利用的研究提供基础资料。

综上所述，从紫茎泽兰叶第四级提取物对鸡球虫具有较强的抑制作用，对鸡球虫病的疗效略优于高效抗球虫药物地克珠利，其毒性虽稍大于地克珠利，但对试验鸡的毒副作用较轻，未对小鸡机体造成大的损害。

致谢：本试验得到云南省森林灾害预警与控制重点实验室的鼎力支持，在此表示感谢。

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