大白菜小孢子培养

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摘要：大白菜是我国北方地区比较常见的蔬菜，但是受到育种年限的限制其育种周期比较长，白菜是异花授粉植物，杂种优势非常明显，因此在育种过程中，单倍体育种研究十分重要。常规育种中，一个杂合基因型的大白菜育种材料往往需要5～7代连续自交才能培育出可用作杂交种亲本的系统。游离小孢子培养是一种在单细胞水平上获得双单倍体系统的方法，可在最短的时间里获得优良纯系。一个杂合基因型的大白菜育种材料往往需要4～5代连续自交才培育出可用杂交种亲本的系统，而通过游离小孢子培养只需1～2年就可以得到多种基因型的纯合体，因此，游离小孢子是创造稳定变异材料的准确方法。

关键词：大白菜；小孢子培养；材料方法；影响因素

中图分类号： Q94-333 文献标识码： A 文章编号： 1674-0432（2013）-08-16-1

前人的研究结果有：第一，在基因型上kuginnuki发现热带品种有较高的胚生成能力和再生能力。第二，在供体植株生长环境上张凤兰发现以生长在14～16u日照高于及15℃～20℃的温度条件下供体植株的胚状体发生率和植株再生率高于自然条件下生长的植株。第三，在激素浓度上，徐艳辉等报道，6-BA的培养可以大大提高大白菜小孢子的胚诱导率。

1 材料、方法

1.1 实验材料

在生产中应用的15个大白菜品种（四季王、水师营91-12、顶上、沈阳快菜、福田50、四季全能50、早春一号、春大王、韩美黄、吉白桔红芯一号、沈阳改良快菜、龙威快菜、福特二号、福尔特），在2012年3月春季进行播种。以白菜一代杂交种为实验材料，种子于2012年2月15日在4℃冰箱中春化25天，3月12日播种到花盆中，一个月之后开始陆续现花。

1.2 实验方法

小孢子分离纯化。花的大小在2.5～3.5mm，以30～40个花蕾为一组，流水冲洗1h，放在蒸馏水中在4℃的冰箱中预处理5h，预处理之后取出放在插漏里进行外植体灭菌，75%酒精灭菌30s，用灭过的蒸馏水进行冲洗，在用升汞浸泡7min后倒掉升汞，用灭过的蒸馏水冲洗2遍。拿出插漏取出花蕾沥干水分，放在B5洗涤液里用玻璃棒轻轻碾压，挤出小孢子。把收集到的孢子液体用孔径45μm滤网布过滤，最后收集到10ml离心管中等待离心，且在1000转下离心3min，每次取出弃掉上清液再倒入B5洗涤液定容到刻度6ml离心3次，最后离心管中剩下的沉淀即为纯净的孢子。

1.3 游离小孢子培养

在离心管中收集到的小孢子用NLN悬浮液先稀释，然后打散，倒入试剂瓶中，调到1×105～2×105个/ml的浓度，待调好后，每次用枪去5ml加入培养皿中，如需要的话可加入少量的活性炭，适当浓度的活性炭可加快出胚的速度。

2 影响因素

2.1 基因型

供试的12个品种中其中4个品种出了胚，从多到少的顺序依次是：福田50，沈阳改良快菜，龙威快菜，早春一号。

2.2 预处理

最开始取样后在4℃的冰箱中处理，也有放在聚乙二醇中处理一段时间的还有在B5培养基中加甘露醇或者增加糖的浓度提高到17%，还有添加秋水仙素的，预处理。

2.3 热激温度的花蕾容易出胚

热激温度33℃，34℃

2.4 摇床转数

最开始我用的摇床转数是65转，也出胚了，现在用的是50转也出胚了，我个人觉得摇床起的作用是使孢子和NLN充分接触，但是转数不能太小，最后达到出胚的目的。

摇床的转数65转或者50，摇床只是起到摇晃的作用，至于转数不太低就可以。

2.5 培养的温度

一般适合的温度是在25℃左右，一定要暗培养，可以在人工气候箱中进行培养。

2.6 活性炭和AgNO3的影响

活性炭的梯度浓度0.05g/L、0.1 g/L、0.15 g/L、0.2 g/L、0.25 g/L

AgNO3的梯度浓度37.5 g/L、50 g/L、62.5 g/L、75 g/L、87.5 g/L

2.7培养基的成分

A：NLN，

B：NLN+BA0.05mg/L+NAA0.05mg/L，

C：NLN+2，4-D0.1mg/L，

D：NLN+2，4-D0.5mg/L，

E：NLN+BA0.2 mg/L+NAA0.01 mg/L

3结论分析

3.1 基因型对大白菜小孢子胚的影响

供试出胚的4个品种都是抽薹较早的基因型，也就是说抽薹较早的品种北方地区比较爱出胚。一般在沈阳地区采用抽薹比较早的基因型，春结球不容易产生孢子，秋结球的都比较容易。

3.2 培养基成分对大白菜小孢子成胚的影响

做小孢子一般都用NLN培养基，多数用的是1/2NLN，培养基中适当添加生长激素6-BA、NAA，2，4-D有利于出胚，也有研究表明NLN中多加有机物有利于胚状体的发生。前人研究表明培养基的PH值对小孢子的出胚也有一定的影响，PH值偏小的一般比较愿意出胚，PH值高的一般出胚率低，但是也是分品种的。

3.3花蕾低温预处理对大白菜小孢子成胚的影响

低温处理大大提高了小孢子的出胚率，低温也可以暂时保留花的质量。

3.4 取材料的时期对大白菜小孢子成胚的影响

取花一般取盛花期的花，植株主花枝和一级侧枝的花蕾少量开花到一级侧枝的花蕾到已有2/3开花以前。盛花期的花多数上部分的花光照好，花粉活力较强。

3.5 白菜的生长环境对小孢子成胚的影响

白菜的生长环境最好进行加光处理，但是实践的理论研究结果表明，加光处理对花粉的活力影响不大。生长环境的温度控制的不要太高，温度太高的话影响花粉的活力。

作者简介：胡颖 （1982—）， 女 ，河北省井陉县人。就职于沈阳市农业科学院， 从事组培工作。