Osterix过表达对人牙周膜细胞骨向分化的影响
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[摘要] 目的 研究osterix（Osx）过表达对人牙周膜细胞受力后骨向分化的影响，探讨Osx与正畸牙周组织骨改建的关系。方法 采用组织块法培养人牙周膜细胞，用重组质粒pcDNA3.1 flag-Osx转染人牙周膜细胞。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot方法检测未转染组、转染空质粒组、转染Osx组细胞Osx mRNA和蛋白表达水平；并观察核心结合因子α1（Cbfα1）、碱性磷酸酶（ALP）、骨桥素（OPN）、骨钙素（OC）、骨涎蛋白（BSP）和a1（Ⅰ）型胶原蛋白（Col Ⅰ）的mRNA表达情况。3组细胞加载6 h离心力后，观察上述检测指标的变化。结果 转染24 h后，相对未转染组，转染空质粒组Osx mRNA和蛋白水平无明显变化（P>0.05）；而转染Osx组Osx mRNA和蛋白表达水平明显升高（P
[关键词] Osterix； 过表达； 人牙周膜细胞； 机械刺激； 成骨分化
[中图分类号] Q 78 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.021
牙周膜细胞在机械力的诱导下分化为成骨细胞[1]，参与骨吸收和骨形成，是正畸骨改建的关键。牙周膜细胞通过特定的信号转导途径对机械力作出反应，引发一系列细胞生物学反应。此过程涉及多种信号转导通路，近年来少数研究[2-4]发现：一些核内转录因子参与了牙周膜细胞内调控途径，在将细胞外物理或机械刺激转化为协调的细胞反应方面发挥着积极的调控作用。
Osterix（Osx）是近年来发现的一种含有锌指结构的骨形成转录因子，它是成骨细胞分化和骨形成不可缺少的一个关键调节因子，是间充质细胞向成骨细胞分化所必需的[5]。近年来少量研究[5-7]发现：Osx在牙胚、造釉细胞瘤牙源性组织中均有阳性表达，表明Osx可能在牙齿、牙周组织的发育中发挥着重要的作用。笔者前期实验已经证实了在体外机械力作用下人牙周膜细胞内Osx mRNA和蛋白的表达增强，参与细胞的成骨分化[8]。本实验进一步开展了Osx质粒转染实验及后续加载实验，旨在检测多种成骨标志基因表达的变化，从而进一步明确人牙周膜细胞受力后骨向分化过程是否通过Osx信号通路，并探讨Osx在此过程中的作用。
1 材料和方法
1.1 材料
质粒pcDNA3.1 flag-Osx（由美国Tufts大学牙科学院口腔生物研究所惠赠），质粒小提试剂盒、限制性内切酶（Hind Ⅲ、BamH Ⅰ和Xba Ⅰ）、DNA Marker
（大连宝生物工程有限公司），胰蛋白胨、酵母提取物（Merck公司，德国），DMEM培养基（高糖）、胰蛋白酶、琼脂（Sigma公司，美国），LipofectamineTM2000
转染试剂盒（Invitrogen公司，美国），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（杭州四季青生物工程材料有限公司），Trizol（上海Sangon生物工程技术服务有限公司），cDNA反转录试剂盒（Fermentas公司，美国），Light-Cycler FastStart DNA Master SYBR Green Ⅰ（Roche Applied Science公司，德国），山羊抗人、鼠Osx多克隆抗体（Santa Cruz公司，美国），0.45 μm聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluorid，PVDF）膜（Amersham Bio-sciences公司，瑞典）。
IXZ-ILL100型倒置相差显微镜、CX71显微镜及照相系统（OLYMPUS公司，日本），CO2细胞培养箱、
台式冷冻高速离心机（Heraeus公司，德国），梯度聚
合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪（Bio-metra公司，德国），电泳槽、电泳仪、电转仪、制胶器（BIO-RAD公司，美国）。
1.2 人牙周膜细胞的原代培养和鉴定
取11～14岁青少年因正畸而拔除的牙周健康的前磨牙。采用组织块法原代培养人牙周膜细胞，取第2代细胞爬片，用免疫组化SP法进行波形丝蛋白和角蛋白染色，进行来源鉴定。
1.3 人牙周膜细胞的体外转染
1.3.1 重组质粒pcDNA3.1 flag-Osx的初步鉴定 利用限制性内切酶对pcDNA3.1 flag-Osx进行酶切鉴定。按照试剂盒说明，分别利用限制性内切酶Hind Ⅲ建立单酶切鉴定体系，利用限制性内切酶BamH Ⅰ和Xba Ⅰ建立双酶切鉴定体系，混匀后37 ℃水浴2～3 h。取10 μL上述酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察电泳图谱，最终确定是否转化成功。
1.3.2 转染人牙周膜细胞 取生长状态良好的第2～3代人牙周膜细胞，按照每孔2.5×105个接种于6孔细胞培养板。待细胞融合至80%时，按阳离子脂质体LipofectamineTM2000转染试剂盒说明操作，用重组质粒pcDNA3.1 flag-Osx和空载体质粒pcDNA3.1 flag转染人牙周膜细胞。转染4～5 h后移去转染液，加入DMEM完全培养液继续培养，分别于培养后24、48、72 h收集细胞，检测转染后不同时间点Osx基因和蛋白表达情况，并选取培养24 h的细胞进行后续加力实验。
1.4 人牙周膜细胞的体外加力
本研究参照以往的报道[9]，采用离心加力法对
细胞加载机械力。将分别种有无转染、转染空质粒（pcDNA3.1 flag）、转染目的基因（pcDNA3.1 flag-
Osx）3组细胞的6孔板在无菌条件下用无菌密封胶密封，置于37 ℃离心机加力支架中，以离心机加力（631 r·min-1，约80 g相对离心力）6 h。此加力方式相当于对人牙周膜细胞施加接近正畸临床的持续压力，大小约为16 g·cm-2，属于正畸临床轻力范围[8]。
1.5 逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-poly-
merase chain reaction，RT-PCR）
采用Trizol法提取细胞总RNA，并进行质量测定。应用cDNA反转录试剂盒建立反应体系，离心混匀后置于循环变温加热器进行反转录。反应条件为：37 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min。生成的cDNA置冰上进行后续实验或保存于-20 ℃备用。
取2 μL cDNA，采用LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green Ⅰ建立反应体系，放入LightCy-
cler机器内，按照实验说明进行实时定量PCR。反应程序为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s、55 ℃退火10 s、72 ℃延伸5 s，循环45次。融解分析产物特异性，电泳鉴定产物大小。以β-actin作为内参照，用LightCycler Software Ver. 4.0分析目的基因的相对表达水平。本实验中，除了检测Osx mRNA的表达外，同时还检测了核心结合因子α1（core-binding fac-tor α1，Cbfα1），成骨标志基因碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨桥素（osteopontin，OPN）、骨
钙素（osteocalcin，OC）、骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）和a1（Ⅰ）型胶原蛋白（collagen protein a1，ColⅠ）mRNA的表达，以反应细胞的成骨分化情况。其中所用基因引物序列具体见表1。
1.6 Western blot检测Osx蛋白的表达
收集细胞约5×106个，冰上加入适量（200 μL）细胞裂解液（50 mmol·L-1 Tris-HCl、150 mmol·L-1 NaCl、1%Triton X-100、1 mmol·L-1乙二胺四乙酸、10%丙三醇、0.5 mmol·L-1苯甲基磺酰氟化物、10 μg·mL-1亮肽酶素和1 μg·mL-1抑酞酶），裂解细胞，低温离心，获取全蛋白上清，-80 ℃保存备用。采用二辛可酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。
取等量蛋白样品，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE），后将蛋白带转移到PVDF膜上，封闭液封闭，加入山羊抗人、鼠Osx多克隆抗体（1∶250）4 ℃过夜，漂洗后加入用TBS稀释
的辣根酶标记兔抗山羊二抗（1∶2 500），摇动反应1～2 h进行杂交，显色。实验以actin作为内参照，应用JD801图像分析系统测定目的条带的相对积分光密度，分析Osx蛋白表达水平。
1.7 统计学分析
采用SPSS 12.0统计软件包对数据进行单因素方差分析和t检验。
2 结果
2.1 人牙周膜细胞的体外培养和鉴定
倒置显微镜下观察可见，牙周膜组织块在5～10 d内开始有细胞游出，以组织块为中心呈放射状排列生长，20 d爬满培养瓶。人牙周膜细胞呈长梭形，胞体丰满，胞浆均匀，胞核呈圆形或卵圆形。传代后细胞生长旺盛，性状稳定，具有成纤维细胞特性。免疫细胞化学检测结果为抗波形丝蛋白阳性、抗角蛋白阴性（图1）。
2.2 表达载体pcDNA3.1 flag-Osx的酶切鉴定结果
对提取的表达载体pcDNA3.1 flag-Osx进行酶切鉴定，凝胶电泳观察结果见图2。由图2可见，得到的目的片段与预期片段大小一致：pcDNA3.1 flag-Osx经Hind Ⅲ双酶切得Flag-Osx片段；经BamH Ⅰ和
Xba Ⅰ双酶切得Osx片段（约1 200 bp）。
2.3 转染后Osx基因和蛋白表达的检测
转染pcDNA3.1 flag-Osx后，分别于24、48、72 h抽提总RNA，采用实时RT-PCR检测转染效果。转染24、48、72 h，Osx mRNA表达均比未转染时显著上调（P
转染24 h后，转染Osx组Osx mRNA表达水平相对未转染细胞明显升高28.1倍，同时Osx蛋白亦呈现一个强烈表达（P0.05）。加力6 h后，3组Osx表达水平均明显升高，但是相对转染空质粒组和未转染组，转染Osx组Osx mRNA和蛋白表达增强更显著，增加量约为其他两组的2倍（图4、5）。
2.4 转染加力后Cbfα1和成骨标志基因的表达变化
转染空质粒组与未转染组相比，Cbfα1及5个成骨标志基因（ALP、OPN、OC、BSP 和Col Ⅰ）的mRNA表达变化无明显差异（P>0.05）。与未转染细胞相比，细胞转染Osx后，Cbfα1 mRNA表达无明显变化（P>
0.05），但5个成骨标志基因的mRNA表达均明显升高（ALP、Col Ⅰ为P
6 h后，3组Cbfα1 mRNA的表达无明显变化，而ALP、OPN、OC、BSP和Col Ⅰ mRNA的表达水平均升高（P
0.05）。转染空质粒组与未转染组相比，细胞受力后5个成骨标志基因变化无明显差异（P>0.05）；而转染Osx组与未转染组相比，受力后ALP、OPN、OC、BSP和Col Ⅰ mRNA表达量升高更显著（P
3 讨论
Osx是成骨细胞分化和骨形成不可缺少的调节因子[10]，其调控许多重要的成骨早晚期表型和功能蛋
白的表达[5]。Osx过表达可以抑制C3H10T1/2、C2C12 细胞向原来方向分化，同时激活OC和Col Ⅰ的表达，促使细胞发生成骨分化。而在Osx基因剔除小鼠胚胎中，各种成骨分化标志物的表达水平严重降低或缺如，成骨细胞的分化、成熟被完全阻断[7]。本实验在
目的质粒转染及机械加载前后分别检测了5个成骨标志基因mRNA的表达变化。在成骨分化过程中，ALP是一组膜结合糖蛋白，其活性在成骨分化早期即开始升高，ALP的表达是成骨细胞分化的主要特征之一。OPN是基质矿化的调节基因[11]，OPN mRNA在
成骨细胞分化的早期即开始表达；在牙齿发育中，OPN的表达早于BSP，可以作为成骨样细胞分化的早期标志。Col Ⅰ是基质矿化支架，通过整合素受体增加成骨细胞黏附能力和发挥促分化作用[12]。BSP是羟
磷灰石结合形成的起始位点[13]，可以刺激细胞的增
殖，并促进前成骨细胞分化为骨细胞。BSP的表达早于OC，在成熟晚期即开始表达。OC是细胞外基质蛋白，它是成骨细胞成熟的标志[14]，OC mRNA表达在矿化期开始，并逐渐达到高峰。
本实验转染空质粒组与未转染组相比，ALP、OC、OPN、Col Ⅰ和BSP mRNA表达未出现变化，排除了脂质体转染后对实验结果的影响。转染目的基因Osx后，Osx过表达未改变Cbfα1基因的表达，与以往研究结果相一致，这可能是因为Osx位于Cbfα1下游发挥作用[5]；但Osx过表达显著增强了ALP、OPN、BSP、OC和Col ⅠmRNA的表达。以往研究已证明Osx单独作用就足以促使许多重要的成骨细胞分化早晚期标志基因的表达，发生矿化反应[5]。本实验结果说明Osx过表达通过增强ALP、OPN、OC、BSP和Col Ⅰ这些成骨标志基因的表达，能够促进人牙周膜细胞向成骨样细胞分化，进而合成骨基质，实现矿化成骨。正如Osx过表达能有效诱导鼠胚胎干细胞[15]、骨髓基质细胞[16]等分化为成骨细胞系。OC的显著上调部
分说明Osx单独作用即可诱导人牙周膜细胞发生终末成骨分化。由此可以推测，机械力诱导的人牙周膜细胞内Osx高表达同样也将刺激这些成骨分化早晚期表型和功能基因的表达，推动细胞发生成骨分化。因此，从某种程度上来说，机械刺激诱导人牙周膜细胞的成骨分化需要通过上调Osx的表达来实现。
转染Osx组与未转染组相比较，加力作用6 h后，Osx mRNA和蛋白表达进一步增强，ALP、OPN、Col Ⅰ、BSP和OC mRNA表达增强更显著，实验结果证明在机械力诱导人牙周膜细胞向成骨样细胞分化过程中，Osx起着促进作用。机械刺激引起Osx表达增强，进而增强成骨标志基因的表达，从而促进人牙周膜细胞向成骨样细胞分化，参与牙周组织改建的骨形成和骨吸收。可见，Osx作为一个关键的中间环节，在机械力诱导人牙周膜细胞成骨分化过程中发挥着重要的信号级联放大和转导调控作用。
体外培养的人牙周膜细胞表达成骨细胞的部分表型特征[17]，机械力单独作用即可诱导人牙周膜细
胞分化成成骨样细胞[18]。近来研究表明：核内转录
因子参与了细胞内调控途径，将细胞外物理刺激转化为协调的细胞内生化反应[2-5]。本研究结果表明Osx可能是一条新的信号传递途径，参与了机械力诱导的人牙周膜细胞成骨分化过程，这对正畸牙齿移动过程中的骨改建具有重要作用。当然，Osx在此过程中是否是必需的以及是如何具体发挥作用的，还需要进一步验证。牙周膜细胞是一个异质性的细胞群，不仅包含具有分化潜能的成纤维细胞群体，同时包含具有多向分化潜能的未分化的成体干细胞，即牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）。近年来，随着人PDLSCs的分离成功和研究的不断深入，发现PDLSCs不仅具有较强的克隆形成能力，而且表达ALP、BSP、OCN等一系列成骨细胞标志物[19]，同时有研究初步证明张应力能够促进PDLSCs向成骨细胞分化，并推测PDLSCs可能是在机械力作用下成骨细胞分化的主要来源细胞，从而介导骨形成和骨吸收[20]。本研究中机械力加载、Osx过表达诱导的人牙周膜细胞系列成骨基因表达，发生明显成骨反应，可能与牙周膜细胞中PDLSCs的存在和发挥作用密不可分的。当然，具体的检测和分析还需要借助进一步的实验研究。
总之，本研究表明：Osx过表达可促进人牙周膜细胞在机械力作用下向成骨样细胞分化。Osx可能通过介导和调控多种成骨基因的表达，从而在正畸牙周组织的骨改建过程中发挥重要作用。
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