Pokemon蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表达及其意义

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[摘要] 目的 检测膀胱尿路上皮癌组织中pokemon蛋白的表达，分析其与临床病理特征间的关系。 方法 收集2010年3月～2013年8月宁波大学附属医院泌尿外科27例膀胱尿路上皮癌术中切除的癌、癌旁及临近正常组织，应用免疫印迹法（Western blot）检测标本中Pokemon蛋白的表达，并对其与膀胱癌的临床病理特征进行分析。 结果 Western blot检测到Pokemon蛋白在膀胱尿路上皮癌组织中表达较高、在癌旁及正常组织中表达较低，差异有统计学意义（P < 0.05）。膀胱癌组织中Pokemon蛋白表达与肿瘤病理分级有关，而与患者的性别、年龄、吸烟史及TNM临床分期无明显相关。 结论 Pokemon蛋白表达和膀胱尿路上皮癌的发病及恶性程度有关，可能成为膀胱尿路上皮癌治疗的有效靶点。

[关键词] Pokemon蛋白；膀胱尿路上皮癌；免疫印迹

[中图分类号] R737.11 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）07（a）-0056-03

原癌基因Pokemon是转录抑制因子POK家族的成员，它的主要作用是阻遏关键的抑癌基因ARF，使致癌基因发挥作用。现有研究证实Pokemon在淋巴瘤、肝癌、肺癌等不同组织器官的恶性肿瘤中异常表达，但在膀胱癌中的表达状态尚未明确。本研究通过检测Pokemon蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表达情况，探讨Pokemon与膀胱尿路上皮癌发病机制及临床病理特征之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集宁波大学附属医院泌尿外科2010年3月～2013年8月行膀胱肿瘤手术，且经术后HE染色病理诊断明确为膀胱尿路上皮癌，排除外伴发其他脏器原发恶性肿瘤，共27例，取术中切除的癌、癌旁及临近正常组织。27例患者中男22例，女5例；年龄41～81岁，中位年龄67岁；有吸烟史19例，无吸烟史8例；T1+T2期15例，T3+T4期12例；区域淋巴结转移6例，未发现淋巴结转移21例；高分级癌23例，低分级癌4例。

1.2 主要试剂与仪器

RIPA裂解液（碧云天公司），PVDF膜（0.45 μm，Pall公司），BCA蛋白定量试剂盒（Thermo公司），Pokemon抗体（兔多克隆，Abcam公司），β-actin抗体（鼠单克隆，sigma公司），HRP标记驴抗鼠（Jackson公司），HRP标记羊抗兔（妙通生物科技有限公司），ECL发光试剂盒（天根生化科技有限公司）。蛋白定量酶标仪（Biotek公司），蛋白转移电泳仪DYY-7B型（北京市六一仪器厂）。

1.3 Western blot检测

参考文献[1]的方法，切取-80℃低温保存的组织，提取蛋白并定量后在5%浓缩胶和8%分离胶中行电泳、转膜，封闭后按步骤结合一抗、二抗。洗膜后显影曝光。用软件Quantity One分析条带灰度值，计算Pokemon蛋白表达的强度。

1.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 11.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Pokemon蛋白在膀胱癌、癌旁及正常组织中的表达差异

Western blot结果如图1所示，Quantity One软件分析并求得灰度比后，结果显示：Pokemon蛋白在膀胱癌组织、癌旁组织和正常组织中表达分别为（0.715±0.135）、（0.449±0.157）、（0.418±0.163），差异有统计学意义（P < 0.05）。膀胱癌组织的表达高于癌旁组织和正常组织，差异有统计学意义（P < 0.05）；癌旁组织和正常组织的表达比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。

2.2 Pokemon蛋白与膀胱尿路上皮癌各临床及病理特征间的关系

Pokemon蛋白表达与患者性别、年龄、吸烟史及肿瘤的分期、淋巴结转移无明显相关，而与膀胱尿路上皮癌的病理分级有关。见表1。

3 讨论

原癌基因Pokemon（又名ZBTB7A、FBI-1、OCZF、LRF）是POK家族的一员。其编码产物是转录抑制因子，在人类胚胎形成、细胞增殖、分化、抗凋亡中起重要作用[2]。它也是第一个被发现的ARF特异性转录抑制因子，它可通过干扰Rb基因的转录发挥致癌作用。有研究发现Pokemon主要通过ARF-Hdm2-p53-p21信号通路抑制抑癌基因的表达，也可直接抑制p53的活性，促进细胞增殖，因此认为Pokemon是肿瘤发生过程中的关键始动基因[3]。

2005年，Meada等[4]利用组织芯片技术在肿瘤中首次检测Pokemon的表达，发现Pokemon在乳腺癌、肺癌、前列腺癌等人类常见肿瘤中存在过表达。Choi等[3]的研究发现Pokemon异常高表达见于多种实体肿瘤，鳞癌和腺癌是最常见的细胞类型。刘丽英等[5]、高志远等[6]、赵心恺等[7]的研究也得出了类似的结论。本研究使用Western blot方法检测Pokemon在膀胱尿路上皮癌、癌旁及正常膀胱组织中的具体表达，发现Pokemon蛋白在所有的受检组织样本中均表达阳性，且Pokemon蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表达显著高于癌旁和正常组。上述结果提示Pokemon与膀胱尿路上皮癌的发生有关。陈军等[8]、杨红伟等[9]分别在肝细胞癌组织、人胶质瘤中检测Pokemon的表达水平，显示Pokemon存在普遍表达，且在恶性肿瘤组织中存在过表达，与本研究结果一致。

对Pokemon蛋白与膀胱尿路上皮癌各临床病理特征间的关系进行统计分析显示，Pokemon蛋白的表达与病理分级有关。高分级（0.846±0.166）和低分级（0.525±0.131）比较，差异有统计学意义（P < 0.05），可见高分级组的Pokemon蛋白高表达。国内项研究分别在卵巢癌、肝细胞癌以及口腔鳞状细胞癌中均发现Pokemon的表达程度和病理分级相关[10-12]。Kurth等[13]研究发现，低分级膀胱癌出现临床进展的分险仅为高分级膀胱癌的1/5。一组长达20年的随访研究发现，高分级的膀胱癌出现疾病进展分险更高，TaG1膀胱癌为14%，而T1G3则高达45%[14]。提示病理分级是膀胱癌极其重要的预后指标，本研究同样显示Pokemon蛋白的表达和病理分级有关，因此推测Pokemon蛋白在膀胱癌中的表达程度可预测膀胱癌的预后。

Lin等[15]通过对PI3K/Akt和c-Raf/MEK/ERK信号通路的研究发现，Pokemon蛋白的表达沉默可以抑制肿瘤细胞的增殖，并在动物实验中证实敲除Pokemon基因后裸鼠上的移植瘤生长受到抑制，认为Pokemon蛋白是一个明确的致癌因子。Ding等[16]以Pokemon为靶点使用siRNA干扰技术，发现转染rHDL/Chol-siRNA-Pokemon复合物48 h后，Pokemon的mRNA水平明显降低，并影响了其下游Bcl-2基因的表达，显著抑制肝癌细胞的生长、出现肿瘤细胞的变形扭曲并增加凋亡和坏死。因此，Pokemon有望成为人类恶性肿瘤治疗新的靶点。Fang等[11]在129例肝癌患者的手术切除标本中检测了Pokemon的表达并观察其与预后的关系，发现存在Pokemon过表达的患者总体生存期短于Pokemon低表达的患者，并且Pokemon过表达与肿瘤化疗耐药有关，它可通过抑制p53的活性从而阻遏5氟尿嘧啶或阿霉素诱导的肿瘤细胞死亡，因此可推测抑制Pokemon的表达可以促进肿瘤细胞对化疗的敏感性，从而改善患者的预后。

综上所述，Pokemon在人类恶性肿瘤中普遍表达。本研究发现Pokemon蛋白在膀胱癌中的表达水平显著高于癌旁和正常组织，且Pokemon蛋白的表达水平和病理分级有关，此结果提示检测Pokemon蛋白的表达强度可能可以预测膀胱癌的预后。为今后以Pokemon为标志物对膀胱癌进行基因靶向治疗及克服化疗耐药提供了实验基础。

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[7] 赵心恺，宁巧明，孙晓宁，等.Pokemon基因在肝癌细胞中的表达及意义[J].肿瘤防治研究，2012，39（2）：137-139.

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（收稿日期：2014-03-19 本文编辑：苏 畅）