花生脂肪酶基因的克隆分析及表达研究
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摘要：脂肪酶是生物脂肪代谢过程中的重要酶系，在酶工程中具有重要应用价值。本研究利用花生未成熟种子的cDNA文库，克隆了3种脂肪酶基因。序列分析表明，花生3种脂肪酶均具有保守的氨基酸序列和催化活性位点，分属不同的脂肪酶家族。利用半定量RT-PCR对花生3种脂肪酶进行表达研究表明，它们在各组织中的表达模式各不相同，其中AhLipase2在种子萌发时期的子叶中表达量高，可能起到分解储藏油脂，为幼苗生长提供营养的作用。
中图分类号：Q785文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）01-0001-08
三酰甘油脂肪酶广泛存在于生物体中，其主要功能是将三酰甘油（TAG）水解成甘油和游离的脂肪酸，同时具有水解和转酰基的活性。在油料作物种子萌发过程中，种子储藏油脂的分解为幼苗生长提供能量和碳骨架。脂肪酶催化脂肪分解的第一步反应，对于种子萌发和萌发后幼苗的生长具有重要意义。油料作物种子在储藏过程中因为挤压等原因可能引起脂肪分解的启动，导致游离脂肪酸的积累，也是脂肪酶作用的结果，这些游离脂肪酸的氧化和降解作用导致食物的酸败降低种子质量，并且影响了种子提取的食用油的质量。脂肪酶不仅是生物生理过程的重要酶系，还具有重要的工业利用价值。多种真菌和细菌来源的脂肪酶被分离纯化，并广泛应用于去垢剂、食品、造纸、有机合成、生物催化等方面[1]。
脂肪酶是脂肪代谢的重要酶系。在种子形成后期，TAG被储存在种子油体中，由磷脂单分子层包被，脂肪酶只有附着在油水分界面时才会起作用[2]。种子萌发时期，磷脂酶使油体的磷脂单分子层产生缺陷，使脂肪酶能够与TAG底物结合[3]。三酰甘油脂肪酶能够在油/水表面将TAG水解成自由的脂肪酸和甘油，自由脂肪酸进入乙醛酸循环体，最终转变成葡萄糖，为幼苗初期的生长提供能量[4]。但脂肪酶与脂肪相互作用的机理还不甚清楚，是脂肪代谢研究的重要问题[5]。在植物中，从玉米、蓖麻 （Ricinus communis）和紫苑草 （Vernonia galamensis）等种子中已经纯化出脂肪酶[6，7]。近年来，一些在植物中编码三酰甘油脂肪酶活性蛋白的基因被克隆[8～11]。对于植物来源的脂肪酶，一般根据N端序列可以将其分为三类，第一类存在于叶绿体中，第二类缺少N端信号序列，可能分布于胞质溶胶，第三类分布于线粒体中[12]。
目前商业化的脂肪酶主要来源于微生物，而植物脂肪酶具有潜在的重要价值，如利用植物脂肪酶来转化植物油脂，生产生物柴油等[13]。花生是重要的油料作物，种子含油量高达50%以上，其中的三酰甘油为种子萌发和幼苗生长提供了充足的养分，脂肪酶在种子发育和萌发过程中起重要的作用。另外，脂肪酶还关系到花生的储存和籽粒的品质，对下游加工具有重要影响。本实验室已经对花生脂肪酸合成过程的基因进行了详细分析[14～16]，本研究对脂肪降解酶基因进行克隆和分析，为全面了解花生油脂代谢奠定基础。
1材料与方法
11植物材料
本研究以大田种植的鲁花14号花生品种为材料，收集不同发育时期的种子，在液氮中速冻，保存于-80℃超低温冰箱中，用于RNA的提取和cDNA文库的构建。在盆栽条件下取萌发7天的花生子叶和萌发15天的真叶、茎、根，从大田生长的花生植株上收集花、果针和不同发育时期的种子在液氮中速冻，保存于-80℃超低温冰箱中，用于RNA提取和基因表达的研究。
12试验方法
121文库构建和EST测序用于花生cDNA文库构建的mRNA来源于不同发育阶段的花生未成熟种子。200～500 mg花生种子用于总RNA 的提取，试验方法按照RNAgent 试剂盒（Promega） 说明进行。mRNA 的分离和纯化按照PolyATtract mRNA Isolation Systems 试剂盒（Promega） 进行。cDNA的合成和文库构建按Stratagene pBluescript II cDNA文库构建试剂盒进行。从文库中随机挑取克隆，用EZNA Plasmid Minipreps DNA Purification System（Omega Bio-Tek， USA） 制备质粒DNA。纯化的质粒DNA用作模板，以T3或T7通用引物用BigDye Terminator v31 Cycle Sequencing Kit （ABI） 在ABI 3730XL 测序仪上进行测序。
122花生脂肪酶基因的克隆及序列分析通过测序获得大量花生EST序列。将含有较多不可读碱基的低质量序列、长度小于300 bp 的序列、载体序列以及引物序列去除。用Cap3软件对EST 序列聚类分析。将获得的contig和单个的EST 序列用BlastX 在最新NCBI 数据库中（http：//wwwncbinlmnihgov/BLAST/）进行比对注释。用Lasergene SeqMan II Module （DNAStar） （http：//www DNAStarcom） 进行编码序列的预测。多序列比较用ClustalW183 software （http：//wwwchembnetorg/software/ClustalWhtml） 进行。在不同蛋白序列比较中不同颜色氨基酸残基的标出用BoxShade program （http：//wwwchembnetorg/software/BOX_formhtml） 进行。
花生脂肪酶亚细胞定位预测使用TargetP11 Server （http：//wwwcbsdtudk/services/ TargetP/）和 WoLF PSORT（http：//wolfpsortorg/）。
123花生脂肪酶基因的表达分析从花生根、茎、叶、花、果针、种子以及种子萌发过程中的子叶中提取总RNA，以5 μg总RNA为模板，用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis 试剂盒（TaKaRa）合成第一链cDNA。根据克隆的花生脂肪酶基因序列设计基因特异性引物，以cDNA 为模板扩增目的基因片段，以花生actin 基因作为阳性对照和模板加样参考。
2结果与分析
21花生脂肪酶cDNA序列的克隆
从花生未成熟种子cDNA 文库中随机挑选克隆，提取质粒DNA，以T3和T7通用引物进行大规模EST测序。对获得的近 20 000条花生EST进行聚类分析，将获得的contig群和singleton与NCBI数据库中的序列比较，进行初步功能注释。其中3条EST与数据库中拟南芥等植物的脂肪酶基因有高度的同源性，且含有完整的开放读码框，分别命名为AhLipase1 （GenBank登录号： GU902981），AhLipase2 （GenBank登录号： GU902982），AhLipase3 （GenBank登录号： GU902983）。AhLipase1基因ORF长度2 085 bp，编码蛋白长度695 aa，相对分子量783 kD，预测的等电点（pI， isoelectric point）为688；AhLipase2基因ORF长度1 248 bp，编码蛋白长度416 aa，相对分子量457 kD，预测的pI为660；AhLipase3基因ORF长度1 029 bp，编码蛋白长度343 aa，相对分子量382 kD，预测的pI为848。各基因的开放读码框和对应编码蛋白的序列如图1所示。
花生3个脂肪酶蛋白间的差异较大，相互之间的相似性低于50%，而与GenBank中蛋白比对结果表明均属于脂肪酶：AhLipase1与蓖麻（EEF39083）和毛果杨（EEE98509）脂肪酶蛋白相似性达74%；AhLipase2与苜蓿脂肪酶蛋白（AAR29056）相似性达81%。AhLipase3与蓖麻的另一脂肪酶蛋白（EEF51361）相似性达83%，与苜蓿的一个未知蛋白（ACJ85575）最为相近，相似性达89%。所以，预测花生的3种脂肪酶分别属于不同的脂肪酶类型。
22花生脂肪酶序列分析
不同生物的脂肪酶蛋白均包含10个氨基酸组成的保守序列位点：[LIV]-X-[LIVAFY]- [LIAMVST]-G-[HYWV]-S-X-G-[GSTAC]，此基序中的丝氨酸为脂肪酶的活性位点，花生3种脂肪酶蛋白均含有此保守序列位点（图1）。而3种脂肪酶活性位点的氨基酸组成有所不同：AhLipase1为LQFTGHSLGG，AhLipase2为PHYVGHSLGT，AhLipase3为IWLAGHSLGS。
根据推导的花生3种脂肪酶蛋白序列，使用TargetP 软件对花生脂肪酶的亚细胞定位进行研究，预测结果表明：花生AhLipase1氨基端具有质体转运肽，转运肽由40个氨基酸组成，相对分子量约为42 ku，转运肽切割位点预测在R和S之间（图1）；AhLipase2 可能为分泌型蛋白，参与次生代谢过程，氨基端可能具有24个氨基酸组成的信号肽，信号肽切割位点预测在G和S之间（图1）；AhLipase3 氨基端无转运肽，可能存在于细胞质中。
23花生脂肪酶与其他植物来源的脂肪酶蛋白序列比较
在GenBank蛋白保守结构域数据库检索分析表明，3种花生脂肪酶都属于酯酶和脂肪酶蛋白（Esterases and lipases）超级家族，均具有Lipase class 3 （Pfam 登录号PF01764） 保守结构域。该保守区域包括一个由Ser-Asp-His/Glu 组成的三联体催化活性中心，该活性位点包埋在蛋白结构内部，由一个“盖子”所覆盖，使其不能接近底物；当蛋白附着在油水界面时，“盖子”会打开，使脂类底物接近活性位点。其中的丝氨酸活性位点位于保守序列 [LIV]-X-[LIVFY]-[LIVMST]-G-[HYWV]-S-X-G-[GSTAC]中（图1），在AhLipase1中，活性位点分别位于：Ser-460、Asp-521 和His-609，AhLipase1保守区与其他植物脂肪酶的保守区相似性很高，10个氨基酸的保守序列与蓖麻和杨树中的序列完全相同，其他活性位点周围的氨基酸序列也很保守（图2A）。在AhLipase2中，活性位点分别位于：Ser-187、Asp-266和His-305，其保守序列与其他植物中的对应序列相似，但保守性不如Lipase1中高（图2B），10个氨基酸的保守序列的第一位为脯氨酸，不属于保守序列模式中的典型氨基酸残基，与大多数同源序列也不同，但与水稻（BAD09017）（图2B）、高粱（XP_0022444703）和二穗短柄草（Brachypodium distachyon，XP_003572437）等植物的相应氨基酸相同。在AhLipase3中，活性位点分别位于：Ser-164、Asp-254和His-302，与其他植物同源蛋白比较表明，活性位点及其周围的序列较保守（图2C）。
选择与花生3种脂肪酶同源性较高的其他植物来源的24个脂肪酶蛋白进行比较，进化树显示，在单子叶和双子叶植物中均有三种脂肪酶的同源蛋白。这些蛋白明显分为三类，其中AhLipase1与AhLipase3所在的大类亲缘关系较近。AhLipase1与蓖麻和杨树的两个蛋白最为相似；AhLipase2与拟南芥的一个蛋白最相似，与豆科的苜蓿和大豆的两个蛋白也较为相似；AhLipase3所在的大类中，双子叶植物和单子叶植物中的脂肪酶明显分为两类，AhLipase3与苜蓿的两种脂肪酶蛋白最相似（图3）。 24花生脂肪酶表达分析
对花生中3种脂肪酶基因表达研究表明，AhLipase1在种子发育过程中高表达，在花生其它组织中表达量很低，在种子萌发时期的子叶中不表达；结合转运肽预测的结果，AhLipase1可能在质体上起作用，参与三酰甘油合成与分解的动态过程。AhLipase2在种子萌发过程中高表达，在花和种子发育不同时期也有表达，在果针中有微弱表达，而在营养器官根、茎、叶中几乎不表达。AhLipase3在各种组织中均有表达，在果针和根中的表达量相对较高（图4）。比较花生3种脂肪酶在RNA水平的表达模式可以看出，脂肪酶参与花生生长的全过程，不同的脂肪酶分工不同，AhLipase2最有可能参与到三酰甘油的分解，为幼苗生长提供能量。
3讨论
随着基因工程的发展，近年来已有多种植物来源的脂肪酶基因被克隆。但现有的脂肪酶还不能达到工业、农业等应用的要求，克隆新的脂肪酶基因，改良其性质使其高效表达，满足工业、农业应用的要求是脂肪酶研究的重要内容。本研究克隆的AhLipase2基因预测参与到花生种子萌发时期降解存储的油脂，具有生物和工业研究的价值。
本研究从花生种子中克隆了3种花生脂肪酶基因，三者序列差异很大，在其他植物中也存在他们各自的同源序列，其RNA水平在不同组织中也各不相同，证明不同的脂肪酶参与到花生生长发育的各个时期。花生种子含油量高，但不耐储藏，储藏过程中油脂的降解使游离脂肪酸含量增高，导致酸败使花生口味下降，影响花生油的质量。花生脂肪酶在油脂分解的第一步起作用，研究其作用机理和调控因素将为减少花生收后损失奠定理论基础。
植物中的脂肪酸以多种形式存在，如储藏的甘油三酯和组成细胞膜的磷脂，这些脂类分解由不同的脂肪酶完成，因此，植物中的脂肪酶组成一个大的家族，其序列上的差异决定了功能和底物的不同。本研究克隆的脂肪酶是从花生种子cDNA文库中得到的，参与种子发育和萌发等过程，花生中可能还存在其他在种子中不表达或表达量低的脂肪酶，需要对这些脂肪酶进行全面的克隆分析，并对脂肪酶的细胞定位进行进一步的验证，研究其底物特异性和催化特征，对其蛋白功能和酶学特性进行进一步鉴定，从而确定各个脂肪酶的功能。
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