大鼠脑组织匀浆对其BMSCs向神经元样细胞分化的影响
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摘要：目的探讨大鼠脑组织匀浆上清对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经元样细胞分化的影响。方法全骨髓培养法从Wistar大鼠中分离培养BMSCs,流式细胞仪鉴定，预诱导24 h后，分为4组。空白对照组（A组）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）20 ng/mL组（B组）、bFGF 20 ng/mL+正常脑匀浆上清100 μL/mL组（C组）、bFGF 20 ng/mL+损伤脑匀浆上清100 μL/mL组（D组），诱导48 h至细胞分化。免疫细胞化学染色分别检测各组诱导分化后神经特异性烯醇化酶（NSE）、微管相关蛋白-2（MAP-2）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP)的表达。结果第4代BMSCs CD29、CD44和CD34的表达率为99.8%、 99.7%和2.2%；诱导后的细胞均具有神经细胞形态特征。免疫组化染色结果：NSE在诱导各组（B组、C组、D组）的表达率为44.50%、63.10%和73.30%，MAP-2的表达率为45.70%、 65.30%和 75.60%，各组均不表达GFAP。结论大鼠脑组织匀浆上清能提高BMSCs向神经细胞方向分化的阳性率，损伤脑匀浆的作用更强。
关键词：骨髓间充质干细胞 细胞分化 神经元
中图分类号：R741文献标识码：A文章编号：1672-1349(2011)05-0589-02
近年来利用干细胞治疗神经系统疾病越来越受到人们的关注，2001年Stocum［1］阐述了干细胞在再生医学领域的应用前景，随后Daadi等［2］移植胚胎干细胞来源的神经前体细胞治疗缺血小鼠；Rpsser［3］全面阐述了干细胞在治疗神经系统变性病方面的应用。骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)可分化为骨细胞、神经元细胞、神经胶质细胞、肝细胞等［4］，由于其取材对组织损伤小，无伦理道德方面的限制，成为神经细胞移植的良好来源。本实验探讨大鼠脑组织匀浆上清对其bmscs向神经元样细胞分化的影响。
1材料与方法
1.1材料Wistar大鼠（山西医科大学生理实验室）、胎牛血清（杭州四季）L-DMEM(Hyclone)、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，PeproTech）、兔抗鼠微管相关蛋白-2（MAP-2）、神经特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP，博奥森)、羊抗兔二抗(博士德)、即用型SP 试剂盒(博士德)、4%多聚甲醛、PBS、3%H2O2、倒置显微镜、5%CO2 培养箱、酶标仪、流式细胞仪等。
1.2大鼠BMSCs的分离、培养和鉴定BMSCs采用全骨髓贴壁培养法，将细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱内，待细胞生长融合至70%～80%时传代。取第4代的BMSCs，按105/mL水平分5管分别加入F ITC标记的小鼠抗大鼠CD29，CD44和CD45抗体,同型F ITC标记的对照IgGI以及空白对照，经流式细胞仪检测。
1.3脑组织匀浆制备大鼠颈椎脱臼处死取出脑组织，置于玻璃匀浆器中，按150 mg/mL加入预冷的LG-DMEM培养基研磨，2 000 r/min离心15 min,留取上清。无菌条件下过滤，-20 ℃保存备用。采用Longa 线拴法制作大鼠脑缺血再灌注模型，24 h后处死，按上述方法制作损伤匀浆上清。
1.4细胞爬片和诱导取第4代BMSCs，按105/mL浓度接种于铺有盖玻片的六孔板内，分4组：空白对照组(A)、标准对照组(B)、正常匀浆上清组(C)和损伤匀浆上清组(D)。除A组外各组加入含1 mmol/L 和20%胎牛血清的L-DMEM培养基进行预诱导。24 h后倾去预诱导液。A组正常培养，B组加入bFGF 20 ng/mL和10%胎牛血清；C组加入bFGF 20 ng/mL+正常匀浆上清100 μL/mL，D组为bFGF 20 ng/mL+损伤匀浆上清100 μL/mL。
1.5免疫细胞化学鉴定取诱导后48 h的细胞爬片,PBS洗3次,4%多聚甲醛固定30 min；PBS洗3 次,3% H2O2 37 ℃孵育15 min消除内源性过氧化物酶活性;PBS洗3次,山羊血清室温封闭10 min,弃血清后分别加入兔抗大鼠NSE、MAP-2、GFAP抗体,4℃过夜;PBS洗3次后加入生物素标记的二抗,室温下孵育30 min；PBS洗3次,滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液,37 ℃孵育30 min;PBS洗涤,DAB 显色。阴性对照用PBS代替一抗。
2结果
2.1大鼠骨髓MSCs 的光镜形态与细胞鉴定培养24 h后部分细胞贴壁呈多角形，72 h全量换液后贴壁细胞增大、分裂增殖，呈梭形、纺锤形。2周左右细胞汇合至70%～80%时传代。传代24 h 后BMSCs 即可贴壁生长，4 d～5 d 可铺满瓶。传至第3代以后，为形态均一的梭形，排列为旋涡状、状。流式细胞术检测CD29、CD44和CD34的表达率为99.8%、 99.7%和2.2%，说明所分离培养的细胞符合MSCs表型特征。
2.2诱导后细胞形态变化与免疫化学鉴定预诱导24 h,可见少量细胞逐渐向胞核方向收缩，加入各诱导剂后上述变化增多，有突起形成并随时间增长。对照组细胞形态无变化。
各诱导组细胞均有部分细胞NSE 和MAP-2阳性,表现为胞浆呈棕褐色。GFAP染色后各诱导组出现极少量阳性细胞。对照组均不表达NSE、MAP-2和GFAP。从上下左右中等5个方位分别选取2个非重叠视野(×100)，计数每个视野下NSE、MAP-2、GFAP阳性细胞所占比例。详见表1。
3讨论
目前研究表明BMSCs缺乏CD14，CD34和CD45等造血谱系标志，但对CD29，CD44，CD90，CD120和CD124等均呈现阳性反应［5］。本实验采用流式细胞仪鉴定，结果显示所培养的细胞符合BMSCs特征。
多种方法可诱导BMSCs向神经细胞方向分化：①化学药物诱导，Woodbury ［6］ 用β-巯基乙醇、二甲基亚砜等抗氧化物成功使BMSCs 分化为神经元样细胞；②细胞因子诱导，Tropel等［7］用bFGF,Tomita等［8］用多种细胞因子联合诱导BMSCs分化为神经细胞。 ③采用细胞共培养，生物性诱导剂等方法为细胞分化提供有利的微环境。BMSCs能够分化不同类型的细胞，这种可塑性与转录因子和信号转导有关［9］。Woodbury认为BME干预了细胞内的某种信号转导，邢莹等［10］研究显示，BME可能是影响了在细胞分化过程中保守而重要的Notch通道，改变了细胞命运。bFGF的丝裂原样作用可诱导BMSCs 向神经元分化并维持细胞的存活。本实验使用BME预诱导，bFGF和大鼠脑组织匀浆上清作为诱导剂，成功诱导出神经元样细胞。相比于bFGF组，加入脑匀浆上清的诱导组为BMSCs向神经细胞分化和细胞活力的维持提供了更为良好的微环境，诱导效果更佳。脑组织匀浆的这种作用可能与其分泌的多种神经生长因子有关。Chopp发现鼠匀浆与MCSs共培养体系中多种重要的神经细胞生长因子如脑源性神经营养因子、神经生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等浓度升高［ 11 ］;DNA微点阵的研究也表明上述因子的基因表达增加［12］。损伤脑组织匀浆组诱导BMSCs分化的效果更好，可能与神经组织损伤后，机体会产生一系列的变化最终导致各种神经生长因子的分泌量明显增加有关。
本实验表明脑组织匀浆上清协助诱导BMSCs向神经细胞分化，但具体哪些因子以及如何发挥作用有待于进一步的研究；另一方面，大多数神经细胞的鉴定仅限于形态学,而诱导细胞的最终目的是解决患者神经损伤的问题，因此有必要从神经功能方面对其进行鉴定，这一方面尚待更深入的研究。
参考文献：
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作者简介:陈文超(1985―),现为山西医科大学第二临床医学院神经内科硕士研究生（邮编：030001）;刘瑞玲，现为山西医科大学第二医院神经内科硕士研究生；李光来(通讯作者)，工作于山西医科大学第二医院（邮编：030001）。
(收稿日期：2010-12-08）