从面包酵母中提取海藻糖的研究

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摘要：目的研究从面包酵母中提取海藻糖。方法在不同的乙醇浓度、提取温度、提取时间及不同酵母质量浓度下提取海藻糖，测定提取率。用活性炭脱色，阴阳离子交换除杂质和脱色，经浓缩、结晶、干燥，制成海藻糖成品。结果在乙醇体积分数55 ％，提取温度（80±1）℃，提取时间90 min，酵母质量浓度50 g/L条件下，海藻糖的提取率可达92.51％，制得的海藻糖成品纯度为97.23％。结论确定了从面包酵母中提取海藻糖的工艺条件。

关键词：面包酵母；提取；海藻糖

中图分类号：TS245.9文献标识码：A文章编号：1672-979X(2008)03-0024-03

Study on Extraction of Trehalose from Bread Yeast

LI Jing, TAN Hai-gang, GONG Chun-bo, LI Feng-mei, CHEN Yong, YU Cui-fang

(College of Food Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China)

Abstract：Objective To study the extraction of trehalose from bread yeast. Methods The extraction rate of trehalose was determined under the different conditions characterized by alcohol and yeast concentrations, extraction temperature and time. The extraction solution was decolorized by using active carbon, then, desalted and decolorized by anion and cation exchange resins. The desalted liquid was concentrated and crystallized with alcohol, then, dried to form trehalose finished product. Results The extraction rate of trehalose was up to 92.51% under the following condition: alcohol concentration 55 %, extraction temperature （80±1)℃, extraction time 90 min and yeast concentration 50 g/L. The purity of trehalose finished product was 97.23%. Conclusion The extraction technology can be used for the production of trehalose from bread yeast.

Key words：bread yeast; extraction; trehalose

海藻糖（trehalose）是由2个葡萄糖分子通过半缩醛羟基缩合而成的非还原性双糖。自然界中存在的海藻糖一般为（α，α）构型，其分子式为 C12H22O11・2H2O，相对分子质量为 378.33，无水海藻糖的分子结构如图1[1]所示。

天然海藻糖是白色结晶，易溶于水、热乙醇，不溶于乙醚、丙酮，无毒无害，无过敏性，有甜味。2000年10月美国FDA授予海藻糖GRAS（公认安全）地位，并批准进入美国食品领域；2000年11月联合国粮农组织和世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会（JECFA）确认无需限制海藻糖的日允许摄入量（ADI）；2001年9月25日欧盟批准海藻糖作为新型食品或食品配料进入市场[2]。作为一种生物添加剂，海藻糖在食品、医药等方面有着广泛的应用前景。

海藻糖广泛存在于低等植物、藻类、细菌、丝状真菌、酵母、昆虫及无脊椎动物中[3]，酵母特别是面包酵母内海藻糖含量丰富，是目前海藻糖产品的重要来源。由于海藻糖水解酶海藻糖酶与海藻糖共存于酵母细胞内，因此，提取酵母细胞内的海藻糖必须抑制海藻糖酶的活性。我们采用先加热预处理再用水-乙醇溶液高温提取的方法，研究了从鲜酵母中提取海藻糖的工艺。

1实验材料和方法

1.1实验材料

面包酵母（市售）；95 %乙醇、浓硫酸、蒽酮、三氯乙酸、无水乙醇均为国产分析纯；葡萄糖（莱阳产）；海藻糖（Sigma-Aldrich公司）；活性炭、732强酸性阳离子树脂（天津产）；717强碱性阴离子树脂（天津产）。

1.2仪器

旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；电热恒温水浴锅（北京长风仪器仪表公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海福玛实验设备有限公司）；振荡器（哈尔滨东联电子技术开发有限公司）；离心机（北京医用离心机厂）；721分光光度计（尤尼柯仪器有限公司）。

1.3实验方法

1.3.1提取方法和工艺从面包酵母中提取海藻糖的工艺流程为：面包酵母加热预处理乙醇提取冷却、离心上清液浓缩去醇加足量醋酸铅溶液除蛋白质加足量固体草酸钠除铅活性炭脱色阴阳离子交换（阴阳离子体积比2∶1）浓缩乙醇结晶过滤、洗涤、干燥成品

1.3.2酵母菌中海藻糖含量的测定酵母菌用0.5 mol/L三氯乙酸提取，所得溶液中仅有海藻糖。将三氯乙酸提取液和0.2％硫酸蒽酮溶液以1∶4的体积比混合反应，于590 nm波长处测反应液的吸光度值。计算提取液中海藻糖的含量，即酵母菌中的海藻糖量。

1.3.3提取液中海藻糖的定量分析采用纸层析-硫酸蒽酮比色法[4]测定提取液中海藻糖的含量。

1.3.4海藻糖成品性质的测定

（1）海藻糖成品熔点测定：取干燥成品，按文献[5]的方法测定。

（2）海藻糖成品中杂糖的分析：采用纸层析法。以海藻糖和葡萄糖的标准品作为对照品，以正丁醇∶丙酮∶水∶醋酸＝l0∶6∶6∶2为展开剂。其显色剂系统由两部分组成，A液为AgNO3的水-丙酮（1∶200，V/V）饱和溶液；B液是将1 g NaOH晶体溶于100 g乙醇水溶液中制得，其中乙醇∶水＝1∶1。

（3）海藻糖成品纯度的测定:采用硫酸蒽酮比色法测定成品中海藻糖的含量，凯氏定氮法测定成品中蛋白质的含量。

2实验结果

2.1加热预处理时间的确定

将鲜酵母在105 ℃下加热不同时间，然后在酵母质量浓度100 g/L（干基）、55 ％乙醇、（80±1）℃下提取90 min，用纸层析-硫酸蒽酮比色法测定提取液中海藻糖的含量，计算海藻糖提取率，结果见图2。

由图2可见，当加热预处理达到5 h时，海藻糖的提取率达到90.87 ％，再延长时间提取率不再增加，因此，确定加热预处理的最佳时间为5 h。

2.2海藻糖提取参数的确定

从表2可见，影响海藻糖提取率各种因素的程度为：提取温度酵母质量浓度乙醇浓度提取时间。确定海藻糖的最佳提取工艺条件为A3B3C3D1，即乙醇浓度55％，提取温度为（80±1）℃，提取时间90 min，酵母质量浓度50 g/L。在最佳工艺条件下提取海藻糖，提取率可达92.51％。

2.3海藻糖的精制

2.3.1活性炭脱色活性炭用量为样液的1.5 ％，pH 4.0，80 ℃水浴中反应40 min，反应过程中不断搅拌。

2.3.2离子交换用732强酸性阳离子树脂和717强碱性阴离子树脂以2∶1的体积比组成阴阳离子混合床去除各种离子杂质（包括离子型色素），采取的工艺条件是：流速1.5 mL/min，pH 6.0，温度40 ℃。

2.3.3结晶采用比例添加乙醇法进行结晶，并可除去部分残余的盐和色素。将样液60 ℃旋转蒸发至海藻糖质量分数为40 ％～50 ％，加入样液5倍体积的无水乙醇，在30 ℃下不断搅拌，便可得晶体（图3为静置3 d后得到的聚晶照片）。过滤晶体并用95％乙醇洗涤，结晶率在85％以上。干燥后得到较纯的略带黄色的菱柱晶体，即为成品。

2.4海藻糖成品的性质

2.4.1海藻糖成品的熔点测定实验获得的成品在96 ℃时熔化，在120 ℃时有气泡产生，在130 ℃时重新凝结为小颗粒，在210 ℃时再次熔化，与文献[6]描述的海藻糖性质一致。

2.4.2海藻糖成品中杂糖的分析结果见图4。由图4可见，成品经纸层析后仅有一个斑点，且斑点的Rf值和海藻糖标准品的Rf值相同，而与葡萄糖标准品的Rf值不同，由此证明，海藻糖成品中仅有海藻糖一种糖分，无其它杂糖。

2.4.3海藻糖成品的纯度实验获得的成品中海藻糖含量为97.23％，蛋白质含量为0.09％，其它物质含量为2.68％。

3结论

（1）确定了105℃加热预处理的最佳时间为5 h。经加热预处理后，可使海藻糖酶失活，并使酵母细胞壁和细胞膜受到一定程度的破坏，有利于海藻糖的渗出，提高提取率。

（2）确定了提取海藻糖的适宜条件：乙醇体积分数55％，提取温度（80±1） ℃，提取时间90 min，酵母质量浓度50 g/L。在此条件下，提取率可达92.51％。

（3）海藻糖质量浓度为40％～50％时，加入5倍体积的无水乙醇，在30 ℃不断搅拌，可得到晶体，再经过滤、洗涤和干燥后得成品，结晶率在85％以上。

（4）经熔点测定和纸层析对照，成品为海藻糖，纯度为97.23％。

参考文献

[1]Hirasawa R, Yokoiqawa K, Isobe Y, et al. Improving the freeze tolerance of bakers’yeast by loading with trehalose[J].Biosci Biotechnol Biochem, 2001, 65(3):522-526.

[2]张玉华，凌沛学，籍保平．海藻糖的研究现状及应用前景[J].食品与药品，2005，7（3）：8-13.

[3]Chi Z M, Liu J, Zhang W. Trehalose accumulation from soluble starch by Saccharomycopsis fibuligera sdu[J].Enzyme Microb Technol, 2001, 28 (2-3): 240-245.

[4]王兰，肖冬光.纸层析分离洗脱法定量测定海藻糖[J]. 生物技术，2002，12（3）：27-29.

[5]张毓凡，曹玉蓉，冯霄，等. 有机化学实验[M].天津：南开大学出版社，2002：37-41.

[6]谭海刚.产海藻糖合酶菌株的选育及酶学特性研究[D]. 济南：山东轻工业学院，2002：43.