CD147基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建及序列分析

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摘要：目的：利用RNA干扰(RNAi)技术,以cd147为靶基因,设计构建重组表达载体,并进行测序鉴定。方法：设计具有短发夹结构的一对DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pSilencer 4.1-CMV neo构建重组表达载体,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后,并进行序列测定。结果：将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经酶切和测序鉴定确实为所需序列。结论：CD147靶向rna干扰重组表达载体的构建成功，为肿瘤的基因治疗提供了可能。

关键词：CD147基因 RNA干扰 重组表达载体 短发夹RNA

【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1008-1879(2012)03-0011-02

CD147，又被称为促细胞外基质金属蛋白酶因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN）或者basigin，其高度表达在肿瘤细胞的表面，刺激肿瘤细胞周围的成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶。在多种肿瘤中发现CD147高表达，同时MMP 活性增加,与肿瘤的浸润和转移密切相关。

RNAi技术具有特异性和高效性,已经成为研究基因功能的重要工具。RNAi技术是通过导入细胞19 nt-23 nt的小分子干扰RNA(small interference RNA,siRNA),降解同源mRNA,高效、特异性阻断目的基因表达［1］。

1 材料和方法

1.1 材料。含有人U6启动子的pSilencerTM4.1-CMV neo质粒购买于美国ambion公司，克隆用大肠杆菌DH5α购买于大连宝生物公司,限制性内切酶(Bam HⅠ，HindⅢ)及T4 DNA连接酶购买于美国NEB公司,核酸分子质量标准购于宝生物公司,质粒小量抽提试剂盒为天为时代公司产品,胶回收试剂盒购买于广州美津生物公司,DH5α大肠杆菌感受态细胞冻存于-70℃备用。

1.2 SiRNA的制备。根据GenBank中报道的CD147基因核苷酸序列(NM_198589),输入Ambion公司的在线siRNA设计软件,软件将自动分析和显示候选siRNA。据报道的siRNA设计原则和经验,进一步在候选siRNA中筛选最佳者,并在基因库表达序列标签（EST)数据库中用BLAST对靶序列进行同源性分析,排除siRNA非特异性抑制其它基因片段的可能。设计的siRNA由上海吉凯基因化学技术有限公司合成，引物序列见正义链：5- AGCTTAAGACCTTGGCTCCAAGATACTCT CTTGAAGTATCTTGGAGCCAAGGTCG-3，反义链：5-GATCCGACCTTGGCTCCAAGATACTC AAGAGAGTATCTTGGAGCCAAGGTCTTA -3。

1.3 CD147/SiRNA表达载体的构建及鉴定。将DNA Oligo分别用TE(pH8.0)溶解,浓度为100 μmol/L.取相应的正义链和反义链Oligo溶液,退火体系:50 μL = 5 μL(正义链)+5 μL(反义链)+5 μL退火Buffer+35 μL无菌水,在PCR仪上按照如下程序进行退火处理:95℃ 5 min,85℃5 min,75℃ 5 min,70℃ 5 min,4℃保存。退火处理后得到浓度为10μmol的shRNA模板。将所得模板溶液稀释500倍,终浓度为20 nmol/L,用于连接反应，将退火片段与线性载体按摩尔比3∶1的比例进行连接反应,将连接产物分别接种于100 μL的DH5α感受态细胞中进行

转化,涂布于含氨苄青霉素抗性(终浓度为20 mg/L)的LB平板上,37℃恒温箱培养过夜.从每个培养皿上各挑取3个单克隆菌落接种于3 mL含氨苄青霉素抗性(终浓度为20 mg/L)的LB培养液中,37℃恒温摇床培养过夜.用质粒小量抽提试剂盒小量提取质粒后,载体CD147/SiRNA经BamHⅠ和HindⅢ双酶切，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，样本送检行DNA测序,测序公司为大连宝生物有限公司，DNA marker购于北京天根公司。

2 结果

2.1 重组载体的鉴定。HindⅢ和BamHⅠ双酶切重组载体，12%聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，可见55bp处均有明显条带，相应部位测序后碱基序列和设计序列一致（图1）。

2.2 重组质粒测序鉴定 2个重组质粒shRNA编码序列与设计的片段完全一致,表明载体构建正确(图2)。

3 讨论

目前在研究哺乳动物细胞的基因功能方面,产生RNAi效应主要应用的方法有两类:一类为体外转录或化学合成siRNA经脂质体或逆转录病毒载体等转染细胞后介导RNAi,另一类为发夹式siRNA表达载体转染细胞后表达的发夹式siRNAs诱导RNAi.化学合成的siRNAs抑制作用时间短,合成成本昂贵,并且易于污染RNA酶而降解,因此限制其应用.而发夹式siRNAs表达载体转染细胞后表达发夹式s iRNAs成本较低,可以在细胞内RNA酶的作用下被切割成与体外合成的siRNA相同的序列与结构,诱导RNAi效应。

CD147 分子属跨膜糖蛋白,已有许多关于CD147是MMPs产生的诱导者，其主要表达在肿瘤细胞膜，刺激肿瘤细胞周围的成纤维细胞。