不同产地灵芝(赤芝)的HPLC指纹图谱评价

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摘 要：以灵芝药材为研究对象，应用RP-HPLC法，色谱柱为Agilent C18分析柱（4.6 mm×250mm，5μm），乙腈-0.03%磷酸水溶液二元梯度洗脱模式，流速1.0 mL/min，紫外检测波长252nm，柱温35℃，建立了11批不同产地灵芝药材的hplc指纹图谱。同时对各产地药材指纹图谱进行分析，应用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”对各产地药材进行了质量评价，该方法简单可靠，可用于灵芝的质量评价。

关键词：灵芝；指纹图谱；高效液相色谱；质量控制

中图分类号：R284文献标识码：A文章编号：1673-7717(2011)12-2782-03

RP-HPLC Fingerprint for Quality Assessment of Ganoderma lucidum

GUO Xiaolei1, ZHAI Xufeng1, WANG Huaiyu1, BAO Li2

(1.Infinitus(China) Company Ltd,Guangzhou 510665,Guangdong, China；

2.Key Lab of Systematic Mycology and Lichenology,Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100700,China)

Abstract:To establish an RP-HPL fingerprint analysis for quality control of Ganoderm alucidum, HPLC fingerprint analysis method of Ganoderm alucidum was developed. Agilent C18（4.6 mm*250mm，5 μm） column was used, with mixture of acetonitrile and water solution of phosphoric acid as mobile phase in a gradient mode. The flow rate was 1.0 mL/min. The wavelength used in the measurement was 252nm. The batches of Ganoderm alucidum were determined. The HPLC fingerprint chromatograms of different producing area were analyzed. The samples' quality were assessed by similarity evaluation system for chromatographic fingerprint of TCM 2004. The method can be used to identify and evaluate the quality of Ganoderm alucidum conveniently.

Key words:Ganoderma lucidum; fingerprint; HPLC; quality control

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收稿日期：2011-07-11

作者简介：郭晓蕾（1975-），女，辽宁人，主管药师，硕士，研究方向：中药保健食品。赤芝Ganodrm alucidum(Leyss ex. Fr) Karst为担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌，是我国传统的名贵滋补药材，在《神农本草经》中列为上品。现代科研研究证明赤芝具有广泛的生物学活性，能治疗多种疾病，其中三萜类是其主要有效成分，具有明显的抗癌、增强免疫力和保肝护肝等多种药理作用。我国灵芝的主要产地有安徽、江苏、吉林等地，由于生态环境、品种、采收期以及技术的不同，导致药材的品质差异较大，为了避免因质量差异影响到灵芝药材的进一步开发利用，有必要建立全面系统的控制灵芝质量的方法。本实验采用高效液相色谱法对部分不同产地灵芝药材的指纹图谱进行了研究，为灵芝药材的鉴别和质量控制提供了理论依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪，四元梯度泵，DAD检测器，Agilent色谱工作站，Agilent色谱柱，KQ50B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），Sartorius BS110S分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）。

1.2 试剂

色谱甲醇（天津大华），三氟乙酸（Alfa-Aesar），娃哈哈纯净水。对照品灵芝酸A（批号：091110）和灵芝酸B（批号：090928）购自天津一方科技公司。

1.3 材料

实验用灵芝药材由无限极(中国)有限公司提供。

Agilent C18分析柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相为乙腈-0.03%磷酸水溶液梯度洗脱（洗脱程序如下），流速1.0 mL/min，进样量10μL，紫外检测波长252nm，柱温35℃。

2.2 溶液制备

2.2.1 供试品溶液的制备 将干燥灵芝样品粉碎，过60目筛，精密称取其粉末2.0g，加入60mL三氯甲烷溶液，称重，超声提取30min，提取液过滤后减压回收溶剂，残渣用甲醇定量转移到10mL容量瓶中，并定容至刻度，摇匀，045μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即为供试品溶液。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取灵芝酸A对照品20mg，置于10.0mL容量瓶中定容，制备成0.2mg/mL的灵芝酸A对照品溶液；精密称取灵芝酸B对照品3.4mg，置于10.0mL容量瓶中定容，制备成0.34mg/mL的灵芝酸B对照品溶液，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，备用。

2.3 指纹图谱的建立

分别精密称取11批灵芝干燥药材，按照2.2.1所述制备供试品溶液，记录液相图谱。

3 实验结果及分析

3.1 灵芝药材分析方法的建立

图1 灵芝酸A和灵芝酸B标准品和

灵芝药材HPLC色谱图及紫外图谱

在Aglient 1200 HPLC-DAD仪上，采用Agilent C18分析柱（4.6mm×250mm，5μm），乙腈-0.03%磷酸水溶液梯度洗脱，流速1.00mL/min，进样量10μL，紫外检测波长252nm。HPLC色谱图见图1。图1所示为灵芝酸A、灵芝酸B和灵芝药材的HPLC色谱图及紫外图谱，可见在252nm有最大吸收，而且色谱峰数目理想，各色谱峰之间分离度和稳定性良好。

3.2 11批灵芝药材的HPLC指纹图谱分析

3.2.1 11批灵芝药材的HPLC指纹图谱分析 按已优化的色谱条件，对11批灵芝药材进行测试分析，记录色谱图。结果显示：13批样品指纹图谱色谱峰均在60min内全部出完，我们观察到HPLC图谱分为两个区，25min前为灵芝酸类，25min后为甲基化的灵芝酸类物质。结合紫外光谱，我们分析了11批灵芝样品中具有灵芝酸类特征吸收的17个峰，并确定这17个峰为11批样品所共有指纹峰，其中峰7（保留时间16.454min）为灵芝酸B，峰11（保留时间22695min）为灵芝酸A见图2。

图2 灵芝药材的HPLC指纹图谱

3.2.2 浙江产灵芝药材HPLC指纹图谱 本次实验收集了浙江5产地灵芝药材（浙江龙泉龙南乡，浙江林洋乡，浙江龙泉宝溪，浙江龙泉道太乡，浙江龙泉城北乡），对应的指纹图谱见图3所示，利用指纹图谱相似度软件分析，可见浙江5产地的灵芝药材HPLC指纹图谱的共性特征基本吻合，这五批样品的相似度均在0.85以上。见表3。

图3 浙江5产地灵芝药材的HPLC指纹图谱

3.2.3 吉林产灵芝药材HPLC指纹图谱 本次实验收集了吉林4产地灵芝药材（分别为吉林安图，吉林桦甸，吉林抚松和吉林蛟河），对应的指纹图谱如图4所示，利用指纹图谱相似度软件分析，可见吉林安图和吉林蛟河的灵芝药材HPLC指纹图谱的共性特征基本吻合，吉林抚松的灵芝药材HPLC指纹图谱与这两个产地稍有差异，相似度在077，而吉林桦甸的灵芝药材指纹图谱与另3个产地有很大差异。见表4。

收稿日期：2011-07-21

作者简介：石敏娟(1976－)，女，陕西西安人，主管药师,硕士，研究方向：中药指纹图谱。

图4 吉林4产地灵芝药材的HPLC指纹图谱

了安徽2产地灵芝药材（安徽沙河和安徽霍山），对应的指纹图谱见图5所示，利用指纹图谱相似度软件分析，可见安徽2产地的灵芝药材HPLC指纹图谱的共性特征基本吻合，这2批样品的相似度均在0.9以上。见表5。

本实验采用RP-HPLC法测定了11批不同产地的赤芝药材的指纹图谱，发现有17个色谱峰为这11个样品的共有峰，其中可以分为两个区，25min前为灵芝酸类，25min后为甲基化的灵芝酸类物质。结合紫外光谱和标准品比对，我们知道峰7（保留时间16.454min）为灵芝酸B，峰11（保留时间22.695min）为灵芝酸A（图2）。在11批不同产地赤芝指纹图谱中，我们看到除了吉林抚松和吉林桦甸这两个产地的赤芝药材外，其他各产地的赤芝药材HPLC指纹图谱相似度都很高，特别是浙江五产地的HPLC指纹图谱的相似度在85%以上。提示我们赤芝中三萜类成分的含量可能与生长环境和采收期有关。