T细胞分离方法的研究进展

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇T细胞分离方法的研究进展范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

摘要：T细胞是参与机体免疫应答的关键成员，其功能及活化机制等方面的研究一直是免疫学研究的热点。T细胞分为多个亚类，分别通过不同的作用机制参与机体的免疫应答。在T淋巴细胞的表型特征及其功能的研究中，T细胞的分离和纯化显得尤为重要。目前应用较多的分离方法主要有E玫瑰花环形成分离法、尼龙毛柱分离法、免疫磁珠分离法、流式细胞仪分离法等，文章就这几个方法做一综述。

关键词：T细胞；E-玫瑰花环；尼龙毛柱；免疫磁珠；流式细胞术

中图分类号：Q819 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2011）-03-0062-2

T细胞是介导特异性免疫的核心细胞，对其功能及活化机制等方面的研究一直是免疫学研究的热点和前沿，对T细胞的分离纯化可满足深入研究其生物学特性、功能及其表面抗原表位、受体作用的要求。根据T细胞表面不同的标志（主要是表面抗原和表面受体），目前人们已建立多种分离方法并在实际研究中广泛加以应用。

1 E-玫瑰花环形成分离法

玫瑰花环试验是体外检测人和动物细胞免疫功能的一种试验方法。玫瑰花结是1970年Coombs等人在研究淋巴细胞表面抗原或抗原抗体复合物的受体时发现的，他们观察到在自然情况下，人体淋巴细胞能与绵羊红细胞粘附而形成玫瑰花样细胞，因涂片瑞氏染色后，淋巴细胞被染成蓝紫色犹如花芯，而粘附于淋巴细胞周围的绵羊红细胞被染成红色类似花瓣，整个形状如上衣上的装饰品――玫瑰花别针，故称此种细胞为玫瑰花结。1973年国际免疫学会已公认这是T细胞的特征标志之一。

原理是动物外周血液中有T细胞和B细胞。T细胞表面具有红细胞受体，同种或异种动物红细胞与之相遇后、结合，并围绕于T细胞周围排列成为玫瑰花环状。B细胞表面没有红细胞受体，则不能形成玫瑰花环。

E-玫瑰花环在免疫学上的意义及影响、形成的各种因素等等越来越受到学者们的重视。国内外先后报道的有马、牛、驴、鸡、猪、耗牛等[1]十多种动物的E-玫瑰花环试验，其在肿瘤、药物检测应用领域正在逐渐地增加。

E-玫瑰花环形成法需要绵羊红细胞，不但分离效率低，而且需低渗清除红细胞，这对淋巴细胞本身的活性就有较大的影响。另外，其他影响因素仍然较多，比如温度、淋巴细胞的浓度、红细胞是否新鲜和浓度大小、小牛血清、酶、植物血凝素及一些不定因素。

Bernier等[2]的报道中指出在获得纯化的T细胞方面，绵羊红细胞玫瑰花环实验给出的结果不可靠。Indiveri等[3]利用绵羊红细胞的玫瑰花环法和尼龙毛柱法分离人的T细胞并进行了对比，发现两种方法的回收率和纯度相似。Chollet等[4]利用尼龙毛柱和绵羊红细胞的玫瑰花环方法分离淋巴细胞，进行细胞电泳，结果证明，天然T细胞移动速率较快，天然B细胞移动速率较慢。

2 尼龙毛柱分离法

Julius等[5]最早建立了一种快速分离T细胞的方法，他们把鼠的脾细胞和淋巴结细胞悬液加到尼龙毛柱中，37℃，45min，最后获得的T细胞含量在84-91%之间，回收率在50-89%之间。

原理是T细胞表面较光滑，而B细胞表面绒毛较多，混合的淋巴细胞悬液在通过尼龙毛柱时，B细胞、浆细胞、单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上，需用冷洗脱和挤压尼龙棉的方法才可获得，而多数T细胞则通过尼龙毛柱从尼龙毛上洗脱下来。

该方法操作简便易行，无需特殊仪器，对细胞损伤小，重复性好，适合在一般实验室应用。但有研究结果表明分离后T细胞的纯度不高，由于尼龙毛柱上可能会选择性滞留某些T细胞亚群，使其回收率较低、而且操作繁琐，要时刻注意细胞悬液的流速，过快便会造成其他淋巴细胞的混入，降低T细胞的纯度。目前国内现有条件下尼龙毛来源少，不易购得，进口的尼龙毛又非常昂贵，不易于推广，有学者尝试用脱脂棉代替尼龙毛来分离T、B淋巴细胞。

继Julius等的工作之后，国外一些学者[6-9]利用此方法对鸡的脾淋巴细胞、猫的外周血单核细胞、鼠脾细胞、人的扁桃体进行了分离。Antonia Corrigan等[10]对脾淋巴细胞进行了T细胞分离，发现T细胞膜上的磷脂、胆固醇、唾液酸在细胞水平上有所衰退，指出尼龙毛柱分离技术不适用于淋巴细胞的生化学检查。国内一些学者如：姜曼和谢克俭等[11-12]都用脱脂棉柱和尼龙毛柱分离纯化人外周血T细胞并进行了比较，结果两种方法分离的T细胞纯度差别不大，对纯化T细胞的活力影响较小，两者比较差异无显著性(P>0.05)。

3 免疫磁珠分离法

免疫磁珠分离法是近年来国内外研究比较热门的一种新的免疫学技术，应用广泛。免疫磁珠最早是由John Ugelstad[13]等于1979年代制备出的一种与抗体相连的磁化聚苯乙烯微粒，从此被广泛地应用于医学卫生领域的许多方面。

原理是免疫磁珠既可结合活性蛋白质(抗体)，又可被磁铁所吸引。经过一定处理可将抗体结合在磁珠上，使磁珠作为抗体载体与抗原物质结合，形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物，在磁铁磁力的作用下，这种复合物发生力学移动，使复合物与其他物质分离，从而达到分离特异性抗原的目的。

王百林等[14]利用免疫磁珠法对皮肤移植小鼠进行Tm细胞的分离，最后得到CD8+CD4+ 细胞比例占(97.75±0.9)%，CD8+CD4- 细胞比例占(96.0±1.02)%，而CD8+Tm的活细胞百分率为98.5%，得到高纯度的CD8+Tm细胞。

此法具有操作简单、快捷、稳定、重复性好、分离纯度高、保留细胞活性等诸多优点，但也存在一定的问题，不同的细胞其表面物质也不同，这会导致结果的不确定性，进而影响其在临床中的应用。而且需要昂贵的标记好的特异性第二抗体，目前尚难以推广应用，且不同抗体浓度包被的免疫磁珠进行免疫检测时效果差异较大。

4 流式细胞仪分离法

流式细胞技术是上世纪七十年展起来的，利用流式细胞仪进行一种单细胞定量分析和分选的技术。这项技术集合了众多学者们的心血，1953年Parker 和Horst 描述一种全血细胞计数器装置，成为流式细胞仪的雏形。1967年Kamemtsky 和Melamed 在Moldaven的方法的基础上提出了细胞分选的方法。1969年Van Dilla，Fulwyler及其同事发明了第一台荧光检测细胞计。1973年BD公司与美国斯坦福大学合作，研制开发并生产了世界第一台商用流式细胞仪FACS I。

原理是：当经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中，被高压压入流动室内。流动室内充满鞘液，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列以一定速度从流动室喷口喷出。在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体，充电后振动使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴中。将这些液滴充以正负电荷，当液滴流经过带有几千伏的偏转板时，在高压电厂的作用下偏转落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。

孟博等[15]采用流式细胞技术对妊娠期高血压疾病(PIH)患者外周血CD4+T细胞凋亡率对眼底病变的影响进行了检测，表明外周血CD4+T细胞凋亡对PIH的发生发展有一定的预警意义。肖莉[16]利用流式细胞仪对非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血CD4+CD25+调节T细胞水平的变化进行了检测，发现NSCLC组外周血CD4+CD25+调节T细胞水平明显高于健康对照组，且与肿瘤的发生发展密切相关，可作为评估肺癌患者愈后的一项指标。宋海澄等[17]采用流式细胞技术对原发性肝癌患者外周血中的CD3+CD56+T细胞、CD3+CD56-T细胞、CD3-CD56+NK细胞进行了检测，发现CD3+CD56+T细胞在原发性肝癌患者外周血中增生活跃。

流式细胞仪以其快速、准确、灵活、大量、多参数同时分析等优点，已成为免疫学研究领域中无可替代的重要工具。但是流式细胞仪分离法也存在费用高、操作费时、甚至有时可能影响细胞的活性，对细胞损伤较大、且无菌操作难以实现，可能会对分选出来的细胞造成污染而无法进行后续实验等确定。

5 结语

在免疫学研究中，T细胞有效分离方法的不断涌现，极大地丰富了免疫学研究内容，拓宽了研究的深度和广度，同时提高了科研的水平和层次。随着科技水平的不断发展，相信在未来的免疫学领域，各种T细胞分离方法的应用范围也会进一步扩大，应用深度也会进一步加强。

参考文献

[1] 宋耀彬.动物淋巴细胞的E-玫瑰花环试验[J].吉林畜牧兽医.1981,02,24-26,43.

[2] Bernier J,De Guise S,Martineau D,et al. Purification of functional T lymphocytes from splenocytes of the beluga whales (Delphinapterus leucas)[J].Dev Comp Immunol.2000 Sep-Oct;24(6-7):653-62.

[3] Indiveri F,Huddlestone J,Pellegrino MA, et al. Isolation of human T lymphocytes: comparison between nylon wool filtration and rosetting with neuraminidase (VCN) and 2-aminoethylisothiouronium bromide (AET)-treated sheep red blood cells (SRBC)[J].Immunol Methods.1980;34(2):107-15.

[4] Chollet PH,Chassagne J,Sauvezie B,et al.Electrophoretic mobility of human lymphocytes purified by nylon wool columns and spontaneous sheep red blood cells rosetting techniques correlation with immunofluorescence[J].Immunol Methods. 1976;11(1):25-35.

[5] Julius M.H,Elizabeth Simpson,L.A.Herzenberg. A rapid method for the isolation of functional thymus derived murine lymphocytes[J].European Journal of Immunolgy,1973,3(10):645-649.

[6] Stinson R,McCorkle F,Glick B.Nylon wool column separation of chicken thymic-derived (T) and bursal-derived (B) lymphocytes[J].Poult Sci.1978 Mar;57(2):518-22.

[7] Tham KM,Studdert MJ.Nylon wool column fractionation and characterisation of feline lymphocyte subpopulations[J].Vet Immunol Immunopathol. 1985 Jan; 8(1-2) :3-13.

[8] Gunzer M,Weishaupt C,Planelles L,et al.Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail [J].Immunol Methods.2001 Dec 1;258(1-2):55-63.

[9] Hrabák A,Szabó MT,Antoni F.Characteristic biochemical differences in human T and B lymphocytes separated on nylon wool[J].Int J Biochem.1985;17(1):113-7.

[10] Antonia Corrigan,Richard O'Kennedy,Honor Smyth. Lymphocyte membrane alterations caused by nylon wool column separation[J].Journal of Immunological Methods.1979,31,(1-2), 177-182.

[11] 姜曼,许桂莲,黎万玲,等. 脱脂棉及尼龙棉柱分离纯化T细胞的比较研究[J].免疫学杂志.2003,19(4),309-311.

[12] 谢克俭,陈筱华.脱脂棉柱分离纯化人外周血T细胞的实验探讨[J].中华微生物和免疫学杂志.2004,24(2),158.

[13] Ugelstad J,Soderberg L,Berge A,et al.Monodisperse polymer particles a step forward for chromatography[J].Nature,1983,303:95-98.

[14] 王百林,刘增军,翟淑萍,等.小鼠CD8+记忆性T细胞的分离、纯化和体外功能检测[J].贵州医药.2010,34(05),387-390.

[15] 孟博,雷宁玉.外周血CD4+T细胞凋亡率对妊娠期高血压疾病眼底病变的影响[J].中国妇幼保健.2010,25,1898-1901.

[16] 肖莉.非小细胞肺癌患者外周血CD+4CD+25调节T细胞的检测及其临床意义[J].疑难病杂志.2008,7,(4),204-206.

[17] 宋海澄,宋丁,姚树坤.外周血CD3+CD45+T细胞在原发性肝癌患者中的表达及意义[J].中国实验诊断学.2006,10(02),147-149.

作者简介：吴红珍（1983-），女，汉族，山东德州人，吉林农业大学生命科学学院生物化学与分子生物学专业2008级硕士研究生，研究方向：分子免疫学。

通讯作者：张林波（1973-），男，汉族，吉林四平人，吉林农业大学生命科学学院副教授，硕士生导师，研究方向：分子免疫学。