黄芩苷对肝纤维化大鼠相关细胞因子表达的影响

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[摘要] 目的 探讨黄芩苷抗肝纤维化的作用机制。 方法 实验采用CCL4复合因素肝纤维化模型，采用免疫组化、ELISA等技术，观察黄芩苷对肝纤维化模型大鼠肝组织损伤和相关细胞因子表达的影响，分析黄芩苷的预防和治疗作用。 结果 与模型组相比，黄芩苷预防组肝脏损伤及相关细胞因子表达明显改善（P < 0.05），黄芩苷治疗组也有不同程度的改善。 结论 黄芩苷能够减轻肝损伤程度，抑制相关因子TGF-β1、PDGF 、TNF-α的表达，对复合因素诱导的大鼠肝纤维化形成有良好的干预作用。

[关键词] 黄芩苷；肝纤维化；细胞因子；影响

[中图分类号] R-33 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）04（c）-0018-04

黄芩苷（C12H18O11，分子量446）为传统中药黄芩中分离出的黄酮类化合物，具有广泛药理作用，在国内临床上主要用于抗菌、消炎和抗肿瘤等[1-2]，近年实验证实，黄芩苷有明显的保肝作用[3-5]，本实验采用CCL4加营养控制复制肝纤维化大鼠模型，重点观察黄芩苷在干预肝纤维化大鼠模型时，对肝纤维化相关性细胞因子TGF-β1，PDGF，TNF-α在肝脏病理组织及血清中的表达影响，从细胞因子的角度，初步探讨黄芩苷抗肝纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级，雄性，Wistar大鼠50只，体重（140±30） g，由上海中医药大学附属普陀医院实验动物中心提供，许可证号：SCXK（沪）2006-0015。动物自由进食、饮水，1周后使用。实验室饲养温度：（20±2）℃。

1.2 动物分组及模型制备

将50只雄性大鼠随机分成5组：空白对照组，模型Ⅰ组，模型Ⅱ组，黄芩苷预防组，黄芩苷治疗组，每组10只。参照文献[6]制备肝纤维化大鼠模型。除空白对照组外，其余4个实验组于开始2周给予高脂饲料（79.5% 基本饲料+10%玉米油+10%猪油+0.5%胆固醇），此后给予基本饲料喂养。首次给予纯CCL4 5 mL/kg体重皮下注射，此后按3 mL/kg体重皮下注射40%CCL4橄榄油溶液，1周2次，共6周；空白对照组予以等量的0.9%氯化钠溶液皮下注射，次数相同，普通饲料喂养。

1.3 药物干预

自首次造模起，空白组及模型组予0.9%氯化钠溶液灌胃，黄芩苷预防组予黄芩苷混悬液145.8 mg/kg灌胃，每日1次。第6周末处死模型Ⅰ组及黄芩苷预防组大鼠，黄芩苷治疗组第7～8周予黄芩苷混悬液145.8 mg/kg灌胃，每日1次。第8周末处死剩余全部大鼠。每周称重1次，相应调整给药剂量。

1.4 主要试剂

四氯化碳：分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司上海分公司，批号：20050528。橄榄油：化学纯，购自国药集团化学试剂有限公司上海分公司，批号：F20050609。转化生长因子-β1（TGF-β1）多克隆抗体：兔抗鼠TGF-β1抗血清，批号：920605。血小板源性生长因子（PDGF）多克隆抗体：兔抗鼠PDGF抗血清，批号：BA0519。肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）多克隆抗体：兔抗鼠TNF-α抗血清，批号：100060-2004，均购自武汉博士德生物有限公司。黄芩苷（Baicalin）标准品，购自上海君创生物科技有限公司，批号：110715。

1.5 指标测定

肝组织按常规方法行HE染色，参照试剂盒方法行Masson三色胶原染色，光镜下观察肝脏的病理改变，并按照Scheuer法，对各组大鼠肝组织炎症及纤维化程度评分

比色法测定血清白蛋白（ALB）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（AKP）的含量；免疫组化法测定肝组织中细胞因子的表达，用病理图象分析仪测定相关细胞因子灰度值，进行定量分析。酶联免疫吸附双抗体夹心法测定血清中细胞因子的水平。

1.6 统计分析

实验数据以x±s表示，并采用SPSS 11.0软件进行统计处理，符合正态性和方差齐性者，各组间均数差异采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD方法检验；方差不齐时用Games-Howell方法检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芩苷对大鼠肝功能的影响

结果见表1。

与空白对照组相比，模型组大鼠血清ALT、AST、AKP活性均显著升高，而清蛋白含量显著下降。与模Ⅰ组相比，黄芩苷预防组的ALT、AST、AKP活性显著降低；清蛋白含量升高趋势但无统计学差异，与模Ⅱ组相比，黄芩苷治疗组的ALT、AKP活性显著降低（P < 0.01）；AST活性有所降低差异无统计学意义；Alb含量有所升高但差异无统计学意义。

2.2 黄芩苷对大鼠肝组织病理学的影响

HE染色示：空白组肝小叶结构完整，肝索排列整齐，无炎症细胞浸润；两模型组肝小叶结构被破坏，肝索排列紊乱，有炎症细胞浸润，肝细胞水肿、脂肪变性明显，部分可见假小叶形成；黄芩苷预防组及治疗组可见汇管区有少量的纤维组织增生，未见假小叶形成，可见少量炎症细胞浸润，肝细胞水肿、脂肪变性明显减轻。

Masson三色胶原染色示：空白组仅在汇管区有极少量胶原纤维存在，肝小叶间未见纤维组织增生，无假小叶形成；两模型组可见汇管区大量胶原纤维增生，增生的胶原纤维形成纤维分隔，破坏肝小叶结构，分割、包绕肝小叶，有假小叶形成；黄芩苷预防组及治疗组胶原纤维明显减少，只见汇管区有一定的纤维组织增生，少部分亦见胶原向周边延伸，无假小叶存在。

综合HE及Masson染色的镜下表现，按照Scheuer法，进行单盲读片并予以计分。各组得分结果见表2、3。结果显示：与同期模型组比较，黄芩苷预防组及治疗组得分呈不同程度降低，差异均具有统计学意义（P < 0.01）。

2.3 黄芩苷对大鼠肝组织细胞因子TGF-β1，PDGF，TNF-α的影响

2.3.1 相关细胞因子灰度值比较 各组肝组织中相关细胞因子免疫组化阳性产物的灰度值比较见表4。

与模型Ⅰ组大鼠相比，黄芩苷预防组TGF-β1表达的灰度值差异有统计学意义（P < 0.05），TNF-α及PDGF表达的灰度值差异有高度统计学意义（P < 0. 01），与模型Ⅱ组相比，黄芩治疗组TGF-β1及PDGF表达的灰度值无统计学差异，TNF-α表达的灰度值差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.3.2 免疫组化染色结果比较 TGF-β1阳性物质位于阳性细胞的细胞质和（或）细胞膜中，可见棕黄色颗粒。空白对照组（图1）仅见少量表达或无表达，两模型组（图2、3）染色增强，范围较广，主要分布于窦周、门管区周围细胞、中央静脉周围细胞、胶原沉积处、纤维间隔处。与同期模型组相比，黄芩苷预防组（图4）的阳性染色显著减弱，而黄芩苷治疗组（图5）的TGF-β1阳性染色强度有所减弱。

TNF-α阳性物质位于阳性细胞的细胞质和（或）细胞膜中，可见棕黄色颗粒。空白组阳性表达见于肝细胞，仅少量表达（图6）或无表达。两模型组（图7、8）染色增强，主要分布于间质细胞、炎细胞浸润聚集区、纤维间隔处。与同期模型组相比，黄芩苷预防组及治疗组（图9、10）的TNF-α阳性染色显著减弱。

PDGF阳性物质位于阳性细胞的细胞质和（或）细胞膜中，可见棕黄色颗粒。空白组（图11）肝细胞无表达或仅少量表达于动静脉血管壁，弱表达于汇管区基质及间质细胞。两模型组（图12、13）染色增强，增生在纤维间隔区及汇管区最明显，炎细胞浸润聚集区也有分布。与同期模型组相比，黄芩苷预防组（图14）的PDGF阳性染色显著减弱，黄芩苷治疗组（图15）的PDGF阳性染色强度有所减弱。

2.4 黄芩苷对大鼠血清中细胞因子TGF-β1，PDGF，TNF-α的影响

与空白对照组相比，两模型组大鼠血清中细胞因子TGF-β1、TNF-α、PDGF水平显著升高（P < 0.01或P < 0.05）；与同期模型组相比，黄芩苷预防组及治疗组TGF-β1、TNF-α、PDGF水平显著降低（P < 0.01或P < 0.05）。结果见表5。

3 讨论

现有的研究表明，肝纤维化是一切慢性肝病的病理学基础，是形成肝硬化的必经阶段，是一个动态的，具有潜在可逆性的病理过程。阻止肝纤维化的发生和发展是防止慢性肝病向肝硬化和肝功能衰竭过渡的关键环节。

传统医学认为，湿热是肝纤维化形成的启动因子；湿热内蕴血分是导致各种慢性肝病形成纤维化的主要病理基础；湿热疫毒胶着难去则是导致疾病的持续存在和慢性化过程的重要因素[7-8]。中药黄芩有清热燥湿，泻火解毒等作用，是临床上治疗肝病的常用中药。另有研究发现黄芩苷具有抗肺纤维化的作用[9]。这提示了黄芩苷有抗肝纤维化的可能。

本研究证实，长期给予黄芩苷后，经CCL4高脂低蛋白饮食复合因素处理的大鼠肝功能有明显好转，与相应模型组相比，预防组和治疗组大鼠血清ALT、AST、AKP和ALB水平均有不同程度改善，说明黄芩苷具有保肝作用，这与以往的报道相一致。另外，本实验又从组织学水平评价了黄芩苷的抗肝纤维化作用，发现长期应用黄芩苷后，大鼠肝脏组织的纤维化改变明显好转。上述结果充分说明，黄芩苷具有抗肝纤维化的作用。

为进一步明确黄芩苷抗肝纤维化作用机理，本研究对其分子机制进行了初步探索。细胞因子在肝纤维化过程中具有关键作用[10-12]。TGF-β1是激活肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）的关键因子，PDGF是TGF-β1的下游因子，能刺激HSC的活化和增殖，促进肝纤维化的发生和进展过程，TNF-α是介导肝损伤的主要的、终末的介质，对HSC亦有增殖作用[13-15]。以上三种细胞因子在肝纤维化发生和发展过程中起着十分重要的作用，测定它们的含量水平对判断肝纤维化的程度和预后有较大价值。实验结果也证实，与正常对照组相比，模型组大鼠的血液和肝脏病理组织中三种细胞因子的表达均有明显增强。

而且，与相应模型组相比，预防组及治疗组大鼠在肝脏病理组织及血液中的三种细胞因子表达均有不同程度差异，表明黄芩苷可通过抑制相关细胞因子的表达，而发挥抗肝纤维化的作用。

同时，实验结果显示，相对于其治疗作用，黄芩苷预防肝纤维化的效果更为理想，这也进一步证实黄芩苷在抗肝纤维化治疗中的切入点着眼于病理进程的早期阶段，可见在发病初期即施以清热化湿类药物，有利于截断病势的深入和传变，这也复合祖国医学“未病先防，既病防变”的治疗原则。

[参考文献]

[1] Xiao GL，Zhang CH，Liu GD，et al. Clinical study of the effects of baicalin on arrhythmia induced by aconitine poisoning[J]. Med Plant Res，2011，5（1）：88-92.

[2] Seok-Joo Kim，Young-Joo Moon，Sun-Mee Lee. Protective Effects of Baicalin against Ischemia/Reperfusion Injury in Rat Liver[J]. Nat Prod，2010，73（12）：2003-2008.

[3] 王超云，傅风华，田京伟，等. 黄芩甙对化学性肝损伤的保护作用[J]. 中草药，2005，36（5）：730-734.

[4] 宁康健，吕锦芳，姜锦鹏，等. 黄芩苷对小鼠四氯化碳肝损伤保护作用的研究[J]. 中国中医药科技，2011，8（2）：120.