高效液相色谱法同时测定食品中6种对羟基苯甲酸酯

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摘 要 建立了同时检测食品中6种对羟基苯甲酸酯的高效液相色谱二极管阵列检测器（HPLCDAD）定量分析方法。样品用乙腈提取，经LCC18固相萃取柱净化，采用Agilent C18色谱柱分离,甲醇/水溶液梯度洗脱，二极管阵列检测器检测，外标法定量。结果表明：6种对羟基苯甲酸酯在1.0～500.0 mg/L范围内线性关系良好（r≥0.9997）；检出限为0.0016～0.0081 mg/L（S/N＝3）；6种对羟基苯甲酸酯各添加水平在经表面处理的新鲜蔬菜、水果、醋、碳酸饮料及牛奶，食品馅料中的回收率为85.1%～95.4%；相对标准偏差为3.6%～10.9%。

关键词 高效液相色谱法； 对羟基苯甲酸酯； 固相萃取； 食品

1 引 言

对羟基苯甲酸酯为常用防腐剂之一，其抑菌范围广、作用强、用量少、毒性低、易配伍且防腐效果不易随pH值的变化而变化，在碱性环境下尚有效\，对食品起到保鲜与防腐作用。近年来，对羟基苯甲酸酯类防腐剂被广泛应用于各种食品中，但是大量或不当使用防腐剂会对人体造成一定损害，如有雌激素样作用，影响人的内分泌功能等\。因此，中国、加拿大、日本和欧盟等许多国家和国际组织对食品中对羟基苯甲酸酯类防腐剂的使用制定了添加限量\。

目前，对羟基苯甲酸酯的测定方法主要有高效液相色谱法\、薄层色谱法\、气相色谱法\ 、气相色谱质谱法\和毛细管电泳法\等。王萍亚等\用高效液相色谱法测定腌菜中6种对羟基苯甲酸酯； 迪丽努尔・马力克等\用气相色谱法测定液状食品中4种对羟基苯甲酸酯等。这些文献方法多是对一类样品基质中的几种对羟基苯甲酸酯的含量进行测定，适用范围较窄。本研究建立了同时测定蔬菜、水果（经表面处理）、碳酸饮料、牛奶、醋、食品馅料等食品中6种对羟基苯甲酸酯的高效液相色谱二极管阵列检测器的分析方法。与已报道的文献方法相比，本方法的检出限更低，线性范围更宽，适用于同时测定各种食品基质中6种对羟基苯甲酸酯的含量。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

1200高效液相色谱仪（DAD检测器，美国Agilent公司）；4011 Digital旋转蒸发仪（德国Heidolph公司）；XHB型振荡器（江苏康健医疗用品有限公司）；330K台式高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；LCC18固相萃取小柱（美国SUPELCO公司）。对羟基苯甲酸（甲、乙、异丙、丙、异丁、丁）酯标准品（纯度≥99.5%，夺Dr. Ehrenstorfer GmbH）；乙腈、甲醇（色谱纯，美国TEDIA公司）；其它试剂均为分析纯；实验用水均为二次蒸馏水。

2.2 样品的提取

称取5.0 g样品于50 mL 离心管中，加入2 mL 2 mol/L乙酸铵缓冲液（pH＝6.5）振荡溶解，加入2 g NaCl，15 mL 乙腈振荡提取，再加入10 mL 乙腈振荡提取两次，合并提取液于旋蒸瓶中，旋转蒸发至近干，待净化。

2.3 样品的净化

用2 mL 35%甲醇溶解上述步骤处理的残渣，并转入已用5 mL甲醇，5 mL水活化的LCC18固相萃取小柱，用3 mL 30%甲醇淋洗，5 mL 5%氨化甲醇洗脱，收集洗脱液，置于40 ℃氮吹仪上浓缩至干，残渣用2 mL甲醇溶解振荡2 min，过0.45

3 结果与讨论

3.1 色谱条件选择

在参照文献\的基础上选择甲醇和水为流动相，等度洗脱始终不能将对羟基苯甲酸丙酯和异丙酯、丁酯和异丁酯有效分离；因此，对梯度洗脱程序进行优化，在2.4节的色谱条件下，6种对羟基苯甲酸酯得到有效分离，且灵敏度较高。6种对羟基苯甲酸酯标准溶液的色谱图见图1。

图1 6种对羟基苯甲酸酯标准溶液色谱图

Fig．1 Chromatogram of 6 kinds of 4hydrobenzoic acid ester standardsolution

标准溶液浓度为 5.0 mg/L，1. 对羟基苯甲酸甲酯; 2. 对羟基苯甲酸乙酯; 3. 对羟基苯甲酸异丙酯; 4. 对羟基苯甲酸丙酯; 5. 对羟基苯甲酸异丁酯; 6. 对羟基苯甲酸丁酯。

Concentration of standardsolution was 5.0 mg/L, 1. 4hydrobenzoic acid methyl ester; 2. 4hydrobenzoic acid ethyl ester; 3. 4hydrobenzoic acid isopropyl ester; 4. 4hydrobenzoic acid propyl ester; 5. 4hydrobenzoic acid isobutyl ester; 6. 4hydrobenzoic acid butyl ester.

3.2 提取溶剂的选择

对羟基苯甲酸酯难溶或微溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、乙腈等有机溶剂\。本研究对上述几种溶剂的提取效率进行了考察。结果表明，甲醇、乙醇、丙酮、甲醇乙腈（1∶1, V/V）对部分基质的提取效率不高，且提取溶液浑浊，旋蒸过程中易鼓泡，不易操作；乙醚、乙腈对食品中6种对羟基苯甲酸酯的提取效率高，提取溶液清澈，易进行固相萃取净化。国家标准GB/T 5009.312003 \采用乙醚提取，乙醚沸点低，挥发性强，易燃易爆，且产生大量有机废液，为了能同时预处理多种类的样品基质，并可同时检测6种对羟基苯甲酸酯，本研究选择了干扰较少，回收率和选择性都满足要求的乙腈作为提取溶剂。

3.3 净化方法的选择

3.3.1 固相萃取小柱（SPE）的选择 食品种类繁多，含有大量不确定干扰物，进样前需对样品进行有效净化。国家标准GB/T 5009.312003 \采用液液萃取对食品中2种对羟基苯甲酸酯进行净化，操作繁琐，产生大量有机废液。固相萃取净化技术能有效分离目标化合物与基体干扰物，且分析时间短，溶剂使用量少，操作简便。本研究对HLB\ 和LCC18\固相萃取小柱（SPE）进行了优化选择。结果表明，LCC18柱对样品中6种对羟基苯甲酸酯有较好保留，回收率高。因此，选择LCC18柱对样品进行净化。

3.3.2 淋洗液的选择

样品上柱后，有些干扰物质会与被测物一起被吸附，有必要在洗脱被测物前，先淋洗萃取柱去除杂质。在空白样品基质中添加1.0 mg/kg对羟基苯甲酸酯标准溶液，经乙腈提取浓缩后上LCC18固相萃取柱，以不同浓度的甲醇作为淋洗液，考察其回收率，结果见表1。结果表明，采用30%甲醇淋洗液，既能有效去除干扰杂质，又不会将目标化合物洗脱，不同淋洗液的液相色谱图见图2。因此，选择30%甲醇作为淋洗液。

3.3.3 洗脱液的选择 对不同浓度的氨化甲醇洗脱效果进行了考察，洗脱能力随氨水浓度增大而增强，干扰成分也会增加。从表2可见：用5%氨化甲醇洗脱时，6种对羟基苯甲酸酯均被洗下，回收率均较高，且干扰成分少。因此，选择5%的氨化甲醇为洗脱液。