三维调控光纤激光引导PC12细胞突起定向生长

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摘要：目的 本实验采用创新设计的光纤激光束引导装置，精确引导单个PC12细胞突起的定向生长，探求光纤引导低能量激光精确控制神经细胞突起在体外定向生长的新方法。方法 选取体外培养突起生长活跃的PC12细胞为研究对象，将光纤末端经拉制后固定于三维微操上。波长为800nm的激光束经光纤引导投射在靶区域，引导过程中光纤随突起的生长而移动，始终与突起的生长方向保持近似垂直位。每隔5min拍摄一张照片，连续观察30min。结果 30例突起生长活跃的PC12细胞中，20例细胞突起的生长方向可在5min内被波长为800nm的激光影响。在30min的照射中，13例PC12细胞的突起跟随光纤激光束生长，偏转角度在60°及以上的有6例，最大偏转角度可达100°以上。结论 本引导装置可影响PC12细胞突起的生长方向，引导其细胞突起跟随激光生长，为光纤引导低能量激光精确控制神经细胞突起在体外定向生长的提供了一种新方法。

关键词：医学光学；光纤；激光；PC12细胞；生长锥

神经再生修复过程中，再生神经元网络的结构重建关系到神经功能的再生。神经元突起定向生长沿一定路径最后到达靶位，并与下一个神经元形成正确的突触连接过程主要依赖于神经纤维最前端生长锥的活动。生长锥的活动受一系列微环境信号的调控，局部微环境的各种化学或电信号等改变是引导神经细胞定向生长的主要体内因素。在体外培养条件下，突起沿着黏附性最佳的表面前进的特性决定了神经元的网络结构[1]，如体外培养的Neuroblastoma-glioma细胞突起可以沿培养皿表面划痕或沿血浆凝块张力线定向生长。电场对轴突亦具有引导作用，Patel等的实验显示电压梯度广泛存在于发育中的胚胎，并影响着胚胎中轴突的生长[2]。近期研究发现，激光作为一种非接触性的操控方式，也能引导神经细胞生长锥的生长方向。A Ehrlicher等学者采用倒置激光共聚焦显微镜对生长中的神经元轴突进行扫描，引导生长锥的生长[3]。该系统由激光器发射激光后经光路耦合，在倒置激光共聚焦显微镜的载物台中央形成激光陷阱，通过操纵激光陷阱位置成功引导生长锥的生长方向[4]。朱天淳等学者采用倒置式激光陷阱置于PC12细胞的生长锥前方来引导生长锥的生长方向，通过对生长锥施以持续作用力，成功引导了神经细胞生长锥的生长方向，引导成功率达65%[5]。然而传统激光陷阱具有体积大、工作距离短，不宜实现多光镊耦合等缺点，使其更广泛的应用受到限制。而光纤技术克服了上述缺点，以其简单的结构，低廉的价格，光全反射的特性，微/纳米尺度的操控能力等优点，越来越受到研究者们的广泛重视。

本研究拟采用创新设计的光纤激光束引导装置，通过调控三维微操将直径为纳米级的光纤末端定位于生长锥一侧，精确引导pc12细胞单个突起的生长，为光纤引导低能量激光精确控制神经细胞突起在体外定向生长寻求新方法并提供实验依据。

1 资料与方法

1.1试剂与溶液 L -多聚赖氨酸、胰蛋白酶、谷氨酰胺；高糖DMEM，青霉素-链霉素；马血清，胎牛血清；其他试剂均为国产分析纯。所用溶液包括PBS 0.25%胰蛋白酶，PC12细胞培养液。PC12细胞分化培养液。谷氨酰胺在使用前加入到培养基，终浓度为2mM。

1.2细胞培养 PC12细胞株以含10%马血清，5%胎牛血清的PC12细胞培养液维持生长，细胞置于37℃、5%CO2培养箱中培养。待单层培养细胞生长至80%汇合后，0.25% 胰蛋白酶消化，以2×104个/cm2的密度接种于L-多聚赖氨酸包被过的培养皿，进行传代培养。并用PC12细胞分化培养液诱导细胞分化和突起的生长。在倒置相差显微镜下定时观察，记录细胞贴壁以及神经细胞突起的生长情况。

1.3激光引导 光纤激光束引导装置：本实验自行设计组装的光纤激光束引导装置主要由红外激光发射器、光纤、三维微操系统，以及包括对可见光和红外线敏感的电子成像设备组成（图1）。激光发射器参数：全固态半导体激光器，波长 808nm，功率500mw。光纤参数：陶瓷插芯光纤跳线，型号FC/PC-FC/PC-2～3.0mm-MM-3M，光纤代码62.5/125um，插入损耗0.3dB，回波损耗35dB。实验中电子成像设备由倒置显微镜的显微成像系统所组成，通过将其与电脑连接，实验人员可以在计算机屏幕中实时记录神经细胞突起的生长轨迹，监控激光引导实验的过程。

图 1 光纤激光束引导装置三维结构示意图

1.4激光引导方法 选取突起生长旺盛的PC12细胞用于激光引导实验，将目标细胞移至视野中央，光纤固定于三维微操之上，通过操作微操将光纤尖端放置在细胞生长活跃的突起一侧，使激光束照射方向与突起自然生长方向垂直，呈约90°（图2）。倒置显微镜下观察，通过显微照相系统每隔5min拍摄一张图片，连续观察30min，记录神经细胞突起在激光引导过程中的生长轨迹。

图 2 显微镜下激光束方向与生长锥原始生长方向相对位置的示意图（a）和照片（b）。

突起生长过程中，由于激光以及其他因素的影响，其生长方向与位置会时刻发生变化，因此每隔2min，光纤末端的位置也需随着神经元突起的方向与位置移动，使激光照射方向与突起始终保持在近似垂直位。但是光纤末端在定位或者移动过程中始终不能接触细胞和突起的任何部位以及培养皿的表面。同时在激光引导的整个过程中最大程度遮蔽自然光，关闭其他光源，以排除成分复杂的自然光或者灯光的干扰。

1.5数据处理 实验中所有拍摄的图片均由OLYMPUS显微照相机拍摄。放大倍数400×；像素4080×3072；大小：高×宽=18cm×23cm。照片首先均由Adobe Photoshop CS5 进行初步剪切，调色处理，处理后图片大小为：高×宽=1.8cm×2.3cm。最后测量统计突起生长状况和偏转角度。

2 结果

2.1 PC12细胞形态学观察 PC12细胞接种初期，细胞呈圆形，无突起，光晕明显，分布均匀。接种12h后细胞基本贴壁，先前分散的细胞呈现抱团生长，部分细胞可观察到细胞突起生长（图3-a）。24h后，大部分细胞可见突起生长，有的突起较长且增粗，末端膨大呈伞状，其上有若干伪足时刻变换形状与位置（图3-b）。在倒置显微镜下连续观察20min，可见部分突起生长了近5μm。接种48h后，可见PC12 细胞出现多个突起，数目不等，其中有较长、直径较粗，类似神经元轴突样突起，其长度可达PC12细胞胞体直径的2～3倍，可见PC12细胞已成功向神经细胞样分化（图3-c）。

图 3 接种后的PC12细胞

注：a、b、c分别为接种12h、24h、48h后PC12细胞（Scale=20μm）

2.2激光引导实验结果 选取30例胞质均匀、立体感强、突起完好、生长旺盛接种24h后的PC12细胞用于光纤激光引导实验。显微照相系统每隔1min拍摄一张照片，连续观察30min，记录细胞突起的生长轨迹。

如表1、图4所示，在激光引导过程中67%生长活跃的突起都可以在5min内被波长为800nm的激光影响。若以偏转角度（突起偏离原始生长方向的角度） 大于10°为低限，则20例中有13例PC12细胞的突起跟随光纤激光束生长（图5-a、b）。其中，偏转角度在30°以下的有7例，偏转角度在30°～60°的有4例，偏转角度在60°及以上的有2例，其中最大偏转角度可达100°以上。

除突起跟随激光束生长外，实验中亦存在突起在激光照射后背向激光束的方向生长（图5-c）或者突起向胞体方向回缩的现象，分别占10%（3例）和13%（4例）。同时，在30例细胞中有33%（10例）细胞突起的生长不受光纤激光束的影响，在激光引导的30min内既不跟随激光束，也不背向激光束，而是依据其原始的生长方向继续生长或停止生长。

图 4激光对PC12细胞突起生长引导结果（Scale=20μm）

注：每一组中的五张照片分别在激光照射后即刻、6min、12min、21min、30min的拍摄。

如图所示，a、b为两例突起跟随光纤激光束生长的PC12细胞。照片显示了激光引导突起偏转的过程。a、b2例突起偏转角度均大于45°，a偏转大于90°。c为1例突起在激光照射后背向激光束引导方向生长PC12细胞。

3 讨论

"激光陷阱"（optical traps）又名"光镊"（optical tweezers ），可以实现对生物活体样品非接触无损伤的捕获和操纵，自诞生至今20多年以来，广泛应用于微观科学领域 。激光陷阱由激光发射装置发射一定波长和频率的激光，穿过倒置显微镜下方的物镜在载物台形成一个类似光环的陷阱。在其光路传输过程中，经物镜，空气，培养皿底等介质的反射与折射，存在不同程度的能量消耗。

本实验光纤激光引导装置与传统激光陷阱最大的区别在于，其激光束不再通过显微镜物镜本身的光路途径到达载物台，而是通过光纤引导投射于靶区域。实验中光纤激光束引导装置采用NARISHIGE三轴水压微操链接光纤夹持器，通过对微操的调节，控制光纤末端的位置、角度、以及它的运动，准确放置在神经细胞生长锥附近的任意区域，使激光束通过光纤末端传导精确定位于生长锥附近的靶区域内，引导其定向生长。实验所配置的光纤夹持器满足了光纤微/纳米级的移动以及其良好的稳定性。

已有的研究证明780～830nm红外线波长的激光对神经的修复再生具有较好的生物刺激作用。本实验中光纤激光引导装置所采用的激光发射器可产生波长为800nm，能量在0～500mw范围内的激光，激光强度通过调节旋钮调整，并实时在激光发射器的屏幕上显示当前的激光强度。实验所采用的光纤可传输波长为（800±50）nm，能量在0～150mW范围内。为使引导方向更加精确，光纤尖端被拉制成为锥形，其末端直径经测量约为5～10μm，与神经元生长锥直径相宜。同时光纤具有的光全反射特性，使其传导最大程度上保留了激光的能量，减少了激光束自激光发射器产生至投射于生长锥这一传输过程中的能量损耗，便于在引导实验过程中更为精确地控制激光强度。此外，光纤引导完全脱离显微镜本身的物镜光路途径，摆脱固定光路的束缚，使引导更为灵活。其在三维空间中的自由度为构建以及修复活体组织中复杂的神经网络提供了可能。

当生长锥某区域被激光束照射时，激光束自光纤末端发出后呈扇形辐射在这一区域。根据Ehrlicher等学者的实验，分布在生长锥此区域边缘的激光强度必须足够大，方能引起肌动蛋白聚合反应，使生长锥朝此方向偏转[1]。但是为了控制突起生长的方向，生长锥需持续跟随激光束生长，所以突起的生长不需要过多的聚合反应，大量的聚合反应将阻碍生长锥的进一步生长。因此掌握生长锥边缘特定区域内激光的辐射强度，是成功引导生长锥跟随激光引导方向生长的关键。本实验中当激光强度小于1mw时，生长锥往往不容易被激光引导，当激光强度大于5mw，约5min之内， 生长锥被激光束照射的区域将变厚或者密度增加（可在光镜下观察到生长锥此部分颜色加深的画面），生长锥开始改变原有生长方向。如果继续增加激光强度至45mw时，这一区域生长锥生长将停滞。且光纤激光引导结果中，除突起跟随激光束生长外，亦存在突起在激光照射后背向激光束的方向生长或者突起向胞体方向回缩的现象。

光纤末端的直径大小是激光精确引导的关键因素。若光纤末端直径过大，激光束在光线末端将产生一个较大的散射角，在实验中常常会覆盖整一个生长锥，引导效果将难以控制。若选择末端直径较小的光纤，它自身重量和液面张力会使光纤弯曲，同时，在微操调节光纤位置时，轻微的震颤都将引起光纤末端的"大幅度摇摆"，相对于脆弱的细胞而言这无疑是极大的破坏。因此本实验选用直径为125μm的silica光纤，经测试，其硬度适宜。在放大镜下剥去光纤末端1cm的保护套后，于酒精灯上拉制，使其末端呈锥形且锥形尖端直径在5～10μm。激光的折射率在空气中为1，在水中为1.3，在富含各种营养物质的DMEM培养液中折射率更高。并将光纤浸入细胞培养液，测量波长为800nm的激光经光纤传导投射在培养液中的散射角度，约为（90°±10°）。

图 5 显微镜下光纤锥形尖端及激光束

注：如图所示为激光经光纤锥形尖端传导，投射在培养皿底部的扇形区，其投射的扇形散角为90°±10°。图中激光的强度被增强，使扇形投射区可以清楚显现。

由于光纤末端不能接触生长锥边缘任何区域，它必需与生长锥边缘存在一定距离，激光在这段距离的培养液中存在一定的能量损耗。因此激光束扇形辐射的各个区域内，激光强度皆不相同，生长锥处于扇形内不同区域可能会产生不同的反应。如本实验中出现的突起跟随、背向激光引导方向生长以及突起回缩等引导结果。

生长锥生长及转向通过神经细胞内细胞骨架的活动来实现。光纤激光引导神经细胞突起定向生长的机制尚无定论。依据目前研究可知，光纤激光束引导装置所产生的光作用力可分为两部分：一种是梯度力，将粒子拉向光场增强的方向；另一种是散射力，将粒子推向光传播的方向。光纤激光束装置的激光发射器产生波长为800nm的激光，耦合于光纤传输。光纤的末端经拉制后呈尖端口径为5～10μm的锥形，激光从锥形末端输出，作用于生长锥。该锥形光纤相当于传统光镊中的显微物镜，将光束会聚。但锥形光纤的径向方向，光场梯度力仍起主导作用，作用力指向轴线。生长锥内肌动蛋白微粒受激光梯度力和散射力的影响在生长锥边缘聚集，从而发生聚合和解聚反应，使生长锥伪足朝激光方向延伸，生长锥跟随激光生长。

另外具有一定能量的光子激光照射在生长锥上会引起局部温度上升，温度是否是激光引导生长锥偏转的原因？有研究表明：波长为800nm的激光在水中或者DMEM中连续照射仅仅引起局部温度较小的上升，与环境温度相比甚至可以忽略不计[4]。因此，激光照射过程中，生长锥局部温度的变化可能不是引起生长锥受激光影响而偏转的原因之一。

总之，本实验通过创新设计的光纤激光束引导装置将波长为800nm的激光通过光纤引导投射于PC12细胞生长锥的一侧，精确引导其生长方向。结果提示该光纤激光引导装置可以用于引导神经细胞突起的定向生长，且引导方向精确，结构简单灵活，其在三维空间中的自由度亦为构建以及修复活体组织中复杂的神经网络提供了可能。

参考文献：

[1]Kaehr B， Allen R， Javier DJ， et al. Guiding neuronal development with in situ microfabrication [J].Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101（46）：16104-8.

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[4]朱天淳，冯秀舟，方建兴，等.激光陷阱引导神经细胞生长方向的研究[J].激光杂志，2006，27 （4）：37-38.

[5]乔晓艳.弱激光对神经元离子通道的影响及其电流检测方法[D].天津：天津大学精密仪器与光电子工程学院，2006.编辑/哈涛