碱性磷酸酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

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【摘 要】碱性磷酸酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达就是从大肠杆菌的pET-44a-BAP质粒中亚克隆编码碱性磷酸酶的基因BAP，通过设计BAP的特异性引物获得大量BAP基因片段，构建pMD19-T-BAP克隆载体，进行酶切，再构建pET-his-BAP表达载体，转化BL21，成功表达出BAP基因的蛋白产物。

【关键词】碱性磷酸酶；基因表达；载体；大肠杆菌

引 言

碱性磷酸酶（Alkaline phosphamse）是一个非特异性磷酸单酯酶，能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相对应的醇、酚或糖。碱性磷酸酶既是生物体内一种重要的调控酶；也是基因工程、临床诊断的一种重要工具酶，已广泛应用于疾病检测、食品检验、医药生产等领域。本实验通过亚克隆、连接、酶切等不同的技术手段，构建碱性磷酸酶基因表达载体，在大肠杆菌中得以表达。

1、材料

1.1 实验仪器。电热恒温水浴锅，电子分析天平，磁力搅拌器，高速冷冻离心机，分光光度计，4度冰箱，摇床，微量移液器，涡旋振荡器，电泳仪，PCR仪，超净工作台，灭菌锅。

1.2 试剂及溶液。Tris，考马斯亮蓝，氢氧化钠，氯化钠，95%乙醇，盐酸，SDS， 琼脂，酵母提取物，乙酸（TAE）缓冲液，LB培养基，转化试剂。

1.3 菌种和质粒。DH5a菌，BL21（DE3）菌，PET-his 菌。PET-his， pET-44a-BAP。

2、方法

2.1 引物的设计。根据pET-44a-BAP上插入的BAP序列，用primer primer 5.0 软件设计引物。引物序列如下：上游引物 5′cggacaccagaaatgcct 3′；下游引物5′gccgctctggggctgaaa 3′

2.2 碱性磷酸酶基因的PCR扩增。在0.2mLPCR微量离心管中按下列剂量配制50μL反应体系：其中Premix Taq酶：45μL、模板质粒pET-44a-BAP：1μL、引物1：1μL、引物2：1μL、Ddwater：2μL，总体积为50μL。PCR结束后，取9μL产物进行琼脂糖凝胶电泳。

2.3 DH5a和BL21（DE3）感受态的制备。将菌液分装到1.5mL预冷的无菌离心管中，冰上放置10min，然后于4℃，5000r/min离心10min。弃上清后，加入1mL的0.1mol/LCaCl2 溶液，混匀，插入冰中放置30min。4℃，5000r/min离心10min。弃上清后，用1mL的0.1mol/LCaCl2 溶液垂悬，插入冰中放置30min。4℃，5000r/min离心10min。弃上清液后，用200μL 0.1mol/LCaCl2 溶液垂悬，超净工作台中按每管100μL分装到1.5mL的无菌微量离心管中，4℃保存。

2.4 PMD19-T-BAP的构建及转化和检测

2.4.1 PCR产物与T载体直接连接

2.4.2 DH5a的转化

2.4.3转化克隆的筛选和鉴定

2.5 pET-his及BAP的酶切和回收

0.5mL离心管中混合下列溶液：Pet-his /PMD19-T-BAP质粒：34μL、Quick HindIII：1μL、Quick BamHI：1μL、10× Quick buffer：4μL，总体积为40μL。混匀，瞬时离心。37℃水浴中酶切30min。取9μL酶切产物，与已知分子量的DNA对比电泳，以确认酶切是否成功。

回收酶切后的目的片段：柱平衡。向胶块加700μLPN，50℃水浴10min。加到吸附柱CA2中，置2min，12000rpm离心1min，倒废液。加600μL漂洗液PW，离心1min，倒废液。重复上述步骤。空转2min，放3min晾干。将吸附柱放到干净的离心管中，加50μL洗脱缓冲液EB，置2min，离心2min，收集DNA溶液。4℃保存。

2.6 pET-his-BAP的构建及转化和检测

2.6.1 BAP与pET-his大片段连接

2.6.2 BL21（DE3）的转化

2.6.3转化克隆的筛选和鉴定

2.7 pET-his-BAP的诱导表达

OD值为0.5时可进行诱导表达。除BL21（DE3）空菌不加IPTG以外，其余的每管都加3μLIPTG，37℃摇菌。含有pET-his-BAP重组载体的菌液1.5-3h梯度摇菌。1.5h，2h，2.5h，3h时各取1.5mLpET-his-BAP重组载体的菌液2500r/min离心15min，倒上清，加入20μL的ddwater震荡混匀后加入20μl的上样缓冲液，封口煮沸5min，立即插入冰中。

2.8 碱性磷酸酶表达的SDS-PAGE检测

进行SDS电泳，用考马斯亮蓝染色。清水中过夜脱色，观察结果。

3、结果与分析

3.1碱性磷酸酶基因的PCR扩增。PCR扩增了两管，各取9μl点样电泳。跑出很亮的条带。

3.2 PMD19-T-BAP的构建及转化和检测。将PMD19-T-BAP导入到DH5a，涂平板培养。产生白色菌落。挑取3个单菌落（白1、白2、白3）至每管3ml的LB培养基里，摇菌。白3清亮，没有菌丝。从而将白1、白2进行提质粒。

3.3 pET-his及BAP的酶切和回收。pET-his质粒的酶切产物进行电泳，条带很亮，与Marker相比也符合事实，与pET-his大片段对应的大样进行回收，得到pET-his大片段。对pMD19-T-BAP质粒酶切产物进行电泳，结果与预期相符，对与目的基因对应的大样进行回收，得到BAP片段。

3.4 pET-his-BAP的构建及转化和检测。从转化的BL21（DE3）中提取质粒，进行酶切，再电泳。B1和B2各有极微弱的两条带。与pET-his质粒相比它们跑得慢。因此两条带里跑得快的是目的基因。这表明pET-his-BAP质粒成功的导入到BL21（DE3）菌中。成功导入pET-his-BAP质粒的BL21（DE3）菌经过IPTG诱导，表达出相应的蛋白产物。

结 语

碱性磷酸酶是早期成骨细胞分化的标志物，在骨矿化过程中的主要作用是为骨矿化提供无机磷酸盐（Pi），同时水解无机焦磷酸（PPi），抑制PPi 对羟磷灰石的抑制作用。目前，ALP主要用于肝脏和骨骼等疾病诊断，由于ALP还有一种胎盘型，因此现在也用于孕妇孕期的检查。妊娠期观察孕妇血清中ALP的规律变化是判断胎盘发育正常与否的良好指标。这证实了本实验的可行性以及往后生物学领域中碱性磷酸酶基因的发展前途。也为微生物发酵实验室以及生化实验室进一步的研究探讨奠定了扎实的基础。

【参考文献】

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