HPLC―ELSD法测定八角茴香中莽草酸的含量

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[摘要] 目的 建立八角茴香中莽草酸含量的hplc-elsd测定方法。 方法 采用Hypersil NH2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），乙腈-水（80∶20，均含0.1%甲酸）为流动相，流速1.0 mL/min，柱温30℃。漂移管温度100℃，载气流速2.5 mL/min。 结果 莽草酸进样量在0.57～11.40 μg范围内线性关系良好（r = 0.999 9）；供试品溶液在24 h内稳定；平均回收率为99.88%（n = 6）。 结论 所建立的方法专属性强，精密度好，结果准确。

[关键词] 莽草酸；八角茴香；HPLC-ELSD法；含量测定

[中图分类号] R927 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）03（b）-0119-02

八角茴香，常绿乔木，高达20 m。其聚合果含大量莽草酸，常由8个骨突果生在中轴呈星状，外表面红棕色，有不规则皱纹，顶端呈鸟喙状，上侧多开裂[1]。主产广西、广东、云南等地[2]。莽草酸是从中药八角茴香中提取的一种单体化合物，有抗炎、镇痛作用，是抗癌药物中间体。有明显抗血栓形成作用，可抑制动、静脉血栓及脑血栓形成[3]。莽草酸是世界上对付禽流感的唯一武器，莽草酸是可有效对付致命的H5N1禽流感病毒的药物“达菲”的重要成分。

莽草酸（shikimic acid）为三萜酸，结构式见图1。它是有机弱酸，在水溶液中易解离。现有的HPLC分析检测方法主要有以下几种：①直接用ODS柱测定，结果发现莽草酸不经吸附就可直接出峰。为了在常规的ODS柱上延长莽草酸的保留时间，一般要加入磷酸缓冲盐溶液[4]，或强酸溶液（HClO4，pH=2.5）[5-6]，或离子对试剂[7]。但是，磷酸盐缓冲液系统和强酸溶液会增加对反相色谱柱损坏的程度。②采用氨基键合相硅胶柱[8]，不需要加入强酸做流动相，即可获得令人满意的分离效果。③在检测波长的选择方面，现有文献均用213 nm左右的波长进行测定，但是该吸收峰接近末端吸收，易受杂质干扰。相比之下，蒸发光散射检测器（evaporative light-scattering detector，ELSD）由于其独特的检测原理却可以克服紫外检测器的不足，这是因为ELSD检测器适用于分析没有紫外吸收或者只有末端吸收的成分，其响应不依赖于样品的光学特性，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测。ELSD的响应值与样品的质量成正比，因而能用于测定样品的纯度或者检测未知物。因此，为了提高莽草酸含量测定的准确性，本文选择了氨基键合相硅胶柱和蒸发光散射检测器进行含量测定研究。

1 仪器与试药

Agilent 1100 HPLC，Alltech 2000型蒸发光散射检测器；色谱柱：Hypersil NH2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），大连伊利特。

莽草酸标准品（芜湖甙尔塔医药科技有限公司，纯度98%）；八角茴香药材购于广西并由浙江医药高等专科学校王和平教授鉴定为八角茴香Illicium verum Hook. F.。乙腈为色谱纯（Fisher公司），甲酸（分析纯），水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 标准品溶液的制备

精密称取莽草酸28.5 mg，用甲醇溶于25 mL量瓶中，定容至刻度，摇匀，作为莽草酸标准储备液。精密量取储备液5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀作为莽草酸的标准品溶液，浓度为0.57 mg/min。

2.2 供试品溶液的制备

取本品粉末（过3号筛）0.5 g，精密称定置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，摇匀，称定质量；超声处理（功率250 W，频率30 kHz）40 min，室温放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀。以0.45 μm滤膜过滤，取滤液，即得。

2.3 含量测定

2.3.1 液相条件 柱温：30℃，流动相：乙腈-水（80∶20，均含0.1%甲酸），流速1.0 mL/min，漂移管温度100℃，载气流速2.5 L/min。进样量10 μL。标准品和样品色谱分离见图2、3。

2.3.2 标准曲线绘制 取上述莽草酸标准品溶液（0.57 mg/mL），然后按“2.3.1”项下色谱条件，分别精密吸取1、2、4、6、8、 10、12、14、16、18、20 μL注入液相色谱仪，分析并记录结果（色谱峰面积）。以标准品进样量（X，μg）为横坐标，峰面积A为纵坐标（Y），进行线性回归，得莽草酸回归方程及相关系数如下：Y = 550.797 6X + 72.557 9，r =0.999 9。结果表明，莽草酸进样量在0.57～11.40 μg范围内线性关系良好。

2.3.3 精密度试验 取莽草酸标准品溶液（0.57 mg/mL），重复进样5次，每次10 μL，记录色谱峰面积，RSD为1.26%。

2.3.4 重复性试验 取同一批八角茴香药材，按“2.2”项下方法，重复5次取样制备供试品溶液，按“2.3.2”项下方法测定并计算含量，莽草酸含量的RSD为1.79%。

2.3.5 回收率试验 取已知含量（5.84%）的同一批八角茴香药材，精密称取5份，每份约0.05 g，分别精密加入莽草酸对照品溶液（1.14 mg/mL）3 mL，然后按“2.3.2”项下方法测定含量，并计算回收率，具体结果见表1。

2.3.6 稳定性试验 称取八角茴香样品0.5 g，按“2.2”项下方法处理，得供试品溶液，分别于0、2、4、6、10、16、24 h测定莽草酸含量，记录相应峰面积，计算5次进样测得峰面积的RSD值。结果莽草酸峰面积的RSD为1.43%，表明供试品溶液在24 h内基本保持稳定。

3 讨论

3.1 色谱柱的选择

本实验对ODS柱和NH2柱的分离效果进行了比较。直接用ODS柱测定，发现莽草酸不经吸附就直接出峰。考虑到这可能是由于莽草酸的电离引起的，而在NH2柱上莽草酸可以获得较好的分离。

3.2 流动相的酸度

发现流动相的酸度对莽草酸的保留时间有较大影响，流动相（含0.1%甲酸）室温放置2 d后，莽草酸的保留时间明显延后（从9 min延长到12 min）。因此提示流动相要临用现配。

3.3 检测器的选择

通过对莽草酸现有检测方法的考察，发现常规紫外检测中存在着末端吸收的问题，为了避免该问题，本文选择了更具通用性的蒸发光散射检测器，该方法具有简便快速、结果准确、重现性好的特点。

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（收稿日期：2012-10-12 本文编辑：卫 轲）