ERK信号通路在癫痫大鼠海马中的激活及托吡酯的保护作用

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[摘要] 目的：采用氯化锂-匹罗卡品诱导的大鼠实验模型，研究急性致痫大鼠海马中erk蛋白及下游NF-κB的活性改变，并观察托吡酯（TPM）的干预作用。方法:取健康wistar大鼠36只，随机分成5组，对照组，氯化锂-匹罗卡品处理组和三个剂量的TPM组。应用免疫印迹法检测海马组织中ERK蛋白磷酸化及下游NF-κB 蛋白表达的变化，并观察TPM干预后的行为学改变。结果：(1)急性癫痫发作后0.5h,除对照组外各组大鼠海马组织中磷酸化ERK及活化NF-κB水平均升高；（2）发作2.5h后，处理组大鼠海马组织磷酸化ERK及活化NF-κB水平均下降，但仍高于正常水平；而TPM中剂量及高剂量干预组中大鼠海马组织磷酸化ERK及活化NF-κB水平明显高于低剂量组及处理组结论：ERK通路在大鼠癫痫急性发作的海马体中能被激活，自发保护神经元细胞阻止凋亡，NF-кB参与此过程；而托吡酯能将激活的持续时间延长，激活的后续水平提高，这可能是TPM保护作用的重要机制。

关键词: 癫痫；ERK ； NF-κB； 托吡酯

中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：1004-7484（2012）06-0100-03

作为神经系统的常见疾病之一，癫痫在我国的发病率已超过7‰,目前研究表明，癫痫的发生于离子通道、神经胶质细胞及神经递质都有密切关系[1]。现有的药物已能在很大程度上控制癫痫的急性发作，但是癫痫反复发作后会造成一定程度脑损伤，导致神经元凋亡以及功能失调，尚不能完全解决[2]。托吡酯(TPM)是由氨基磺酸酯取代单糖的新型抗癫痫药物，能通过切断钠通道，提高GABA激活受体的频率。有研究表明，TPM还具有保护神经元作用，其机制尚未明确[3]。本实验通过复制急性癫痫大鼠模型，并通过观察癫痫大鼠行为学，探讨TPM的干预作用，最后通过免疫印迹法，观察ERK蛋白的磷酸化及下游NF-κB 蛋白表达的变化，进一步探讨TPM对神经元的保护作用的可能机制，为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验分组给药及癫痫模型的制备

健康清洁级成年wistar大鼠实验36只，雌雄不限，体重(200 ±30)g,实验分组见表1

组别 n 给药方式

对照组 5 腹腔注射5ml生理盐水

氯化锂―匹罗卡品组

(处理组) 6 腹腔注射氯化锂3 mmol/kg, 24小时后注射30 mg/kg匹鲁卡品

TPM低剂量组 7 腹腔注射TPM20 mg/kg，

1h后腹腔注射氯化锂3 mmol/kg, 24小时后注射30 mg/kg匹鲁卡品

TPM中剂量组 7 腹腔注射TPM40 mg/kg

1h后腹腔注射氯化锂3 mmol/kg, 24小时后注射30 mg/kg匹鲁卡品

TPM高剂量组 7 腹腔注射TPM80 mg/kg

1h后腹腔注射氯化锂3 mmol/kg, 24小时后注射30 mg/kg匹鲁卡品

1.2行为学观察

腹腔内注射后连续观察大鼠行为, 并记录癫痫发作的潜伏期、 发作程度和持续时间, 参考 Racine 分级标准[4]。

1.3 取材及白提取及蛋白样本制备

发作后0.5h，将中剂量TPM干预组中4只及处理组中3只大鼠予戊巴比妥钠 (80 mg/kg)深麻醉, 迅速断头、咬开颅骨、剥出双侧海马；发作后2.5h，照以上方法处死剩余动物并取材。

组织白提取试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司，将组织匀浆后按试剂盒要求提取白。

1.4western blot检测ERK磷酸化水平和NF-κB 蛋白活化

用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿法转膜，含5%脱脂奶粉的PBS封闭液封闭1h后加入一抗，4oc孵育过夜，洗膜后加入荧光素标记的二抗37oc孵育1h。采用GAPDH作为内参，用LI-COR Odyssey进行荧光显色并计算条带灰度值。实验均重复至少3次。

1.5 统计学处理

运用SPSS 10.0软件，进行单因素方差分析，显著性水平P

2 结果

TPM对氯化锂― 匹罗卡品诱导的大鼠行为学的影响

生理盐水组无癫痫发作；匹鲁卡品注射后15~18min后出现癫痫III ~I V级发作，6只大鼠出现强直阵挛，3~4h后发作停止；不同剂量TPM干预组的发作程度明显减轻，只在低剂量组有一只I V级发作。采用SPSS进行Ridit分析，匹鲁卡品组R=0.000，TPM低剂量组R=0.3180(P

2.2.1 western blot检测p-ERK水平和NF-κB 蛋白活化的变化

0.5h时间点样品中，与空白对照组相比，各组ERK磷酸化和NF-κB 蛋白活化水平均明显增高，有极显著差异（P

与0.5h时间点样品相比，2.5h时间点磷酸化水平和活化水平下降，有显著差异（P

图 1 图2

图3

3讨论

托吡酯 (TPM)( 2. 3∶4. 5-双氧-1-甲基亚乙基-- D-硫酸果糖)是从果糖的D型镜像体中提取出的一种新型的抗癫痫药。在对体外培养的神经细胞元进行电生理和生化研究中发现托吡酯的抗癫痫作用与阻断神经元异常放电，调节抑制性神经递质与兴奋性神经递质活性都有关系。

促有分裂原活化蛋白激酶 (Mitogen- activatedprotein kinases ,MAPKs) 家族 ,是将细胞表面信号转导至细胞核的重要传递者。目前已知的MAPK通路主要有三组：ERK1/2(细胞外信号调节激酶)MAPK家族，P38MAPK家族，JUK/SAPKMAPK家族。已知后两类通路的激活参与细胞凋亡过程及炎性反应。ERK信号通路主要参与细胞生长增殖与分化，而ERK通路的持续激活可以阻止细胞凋亡的发生[4]。

Kawasaki[2]在1997年的研究中也已发现，在急性癫痫发作的大鼠模型小脑颗粒细胞中MAPK家族的三个成员均被激活，而 P38MAPK和JUN的激活是一过性的，而ERK的活性水平在3h后仍未回到基本水平。

本实验中，处理组的结果与Kawasaki报道中的大致相同，ERK通路在急性发作0.5h后已被激活，2.5h后仍未回到基准水平。由于ERKs通路的主要功能对细胞增殖、分化与维持存活至关重要。可以推想ERKs的持续磷酸化可能是细胞遭受损害后的一种内在保护机制。

而TPM干预组中，急性发作2.5h后的ERKs磷酸化水平中高剂量组与处理组相比有明显升高，与低剂量组亦有显著性差异，中剂量组与高剂量组间无显著性差异；中剂量组中，急性发作2.5h后与0.5h时相比，ERK磷酸化水平虽有下降，但与2.5h时处理组相比，仍有显著升高。这说明TPM干预后ERK通路被持续激活，参与保护癫痫反复发作中易损的脑神经元。

核转录因子( nuclear factor-κB, NF-κB)是一种广泛存在于哺乳动物细胞中的转录因子，是将胞浆内的信号传导至核内的重要媒介。由于NF-κB在细胞死亡时活化增强，故多年来认为NF-κB是导致细胞死亡的因素[2]。然而目前认为这种观点有欠缺，NF-κB活化增强是由于系统受损后细胞保护信号通路被激活，从而起到防止细胞死亡的作用。研究表明，MAPKs可通过磷酸化NF-κB发挥其调控功能[3]。

本实验中，急性癫痫发作后，处理组与生理盐水对照组相比，细胞核内活化的NF-кB明显增高；而2.5h后与0.5h相比水平下降，这可能与ERK通路磷酸化水平下降相关，说明ERK通路与NF-кB之间有相互影响的作用。TPM干预组中，中剂量和高剂量干预组与低剂量及处理组相比，NF-кB一直保持较高活化水平，可能与ERK通路激活水平较高有关，这证实了TMP的保护作用；而中剂量组中，2.5h与0.5h相比，NF-кB活化水平下降应该与JNK通路的失活的影响有关。

综上所述，ERK通路在大鼠癫痫急性发作的海马体中能被激活，自发保护神经元细胞阻止凋亡，NF-кB参与此过程；而托吡酯能将激活的持续时间延长，激活的后续水平提高，这可能是TPM保护作用的重要机制。

参考文献

[1] 臧颖卓,范亚林,李虹等.癫痫发病机制的研究现状[J].脑与神经疾病杂志,2009,17(1):78～80,封3.

[2] 赵文娟, 黄显奋．癫痫中细胞凋亡发生的多元调节机制[ J]．国外医学生理、 病理科学与临床分册, 2002, 20( 1) ：18～ 21．

[3] Perlman JM,Rogers BB,Burns D.Kernicteric Wndings at autopsy in two sick nearterm infants[J]．Pediatrics,1997，99(4)：612～615．