二藤通痹合剂抗类风湿有效部位药效学筛选

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摘 要：目的：对二藤通痹合剂进行有效部位提取，并以抗类风湿药理作用验证其合理性，筛选出最优提取部位。方法：制作大鼠关节炎模型（AA模型），以各组提取液灌胃给药，测量大鼠足肿胀度，测定血清细胞因子白介素-2（IL-2）、白介素-6（IL-6），并取后肢关节做病理组织学检查。结果：二藤提取液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组均对大鼠足肿胀有消炎消肿作用，其中Ⅱ组与模型组比较有统计学意义（P＜0.01）；二滕提取液Ⅱ、Ⅲ组有减轻关节滑膜病变、减轻关节软骨病变作用（P＜0.01）；二藤提取液Ⅰ、Ⅲ组能降低AA大鼠血中IL-2、IL-6水平。结论：优选组分Ⅲ为最佳提取液。

关键词：二藤通痹合剂；大鼠关节炎模型；足肿胀度；白介素-2；白介素-6；病理检查

中图分类号：R284.1文献标识码：A

文章编号：1673-7717(2008)11-2481-03

Pharmaceutical Screening of Effective Fraction of Erteng Tongbi Mixture

WANG Lixin,REN Mingneng,LI Xiaobing,ZOU Yanyan

(The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510405,Guangdong,China)

Abstract:Objective:To select the best extractive fraction of Ertong Tongbi Mixtrue(ETM),the effective parts of ETM was extracted and thier rationality was proved by pharmacological tests on antitheumatioid.Methods:The extractive was divided into three groups(Ⅰ,Ⅱ and Ⅲ).Rat arthritis model(AA modle)was made.The rat was infused by intragastric gavage with different groups of extractive,the degree of rat foot swelling was measured,the level of cytokine IL-2 and IL-6 in serum was tested,and the change of joints was checked by Pathological and histlolgy.Results:All extractive groups on foot swelling can mitigate inflammation and edema.The effects of group Ⅱ is gisnificantly compare to model group(P＜0.01).The effects of groups Ⅱ and Ⅲ on releasing synovial membrane arthropathy and cartilage injuring are remarkable(P＜0.01).The groups Ⅰ and Ⅲ can decrease the level of IL-2 and IL-6 in serum of AA rat.Conclusion:The best extractive is group Ⅲ.

Key words:ertong tongbi mixtrue;rat arthritis model;foot swelling;IL-2;IL-6;pathological examination

中药复方制剂二藤通痹合剂为本院注册制剂，临床用于治疗类风湿关节炎及强直性脊柱炎10多年，疗效显著[1-2]。该药起效快，具有显著的消肿、镇痛、改善关节功能等作用，病人服药5～6h即显效。在临床指标中，晨僵时间、休息痛、双手握力和压痛关节数均有显著的改善，在降低实验室指标方面，能显著降低病人的血沉(ＥＳＲ)、Ｃ反应蛋白(ＣＲＰ)和类风湿因子（ＲＦ）滴度。

该方由中药南蛇藤、鸡血藤组成。南蛇藤（Celastrus orbiculatus Thunb）为卫矛科南蛇藤属植物，性温，味辛，用于祛风胜湿，行气散血，消肿解毒，治疗风湿筋骨疼痛、跌打损伤、痈疽肿毒等疾病。鸡血藤为豆科植物密花豆（Spatholobus suberectus Dunn）的干燥藤茎,性温，味苦微甘，归肝经，有补血活血、通络的功效,用于血虚萎黄、风湿痹痛等症。二者合用共达舒筋活血、温经散寒、通络止痛之功效。

但是，二藤通痹合剂采用传统的中药水提煎煮浓缩的方法制备，有效成分是否充分煎出？笔者拟根据南蛇藤和鸡血藤的化学成分理化特性，对二藤通痹合剂进行有效部位提取，并以抗类风湿药理作用验证其合理性，筛选出最优提取部位。

1材 料

1.1 药物中药饮片南蛇藤（广州致信中药饮片有限公司出品）、鸡血藤（增城市医药总公司中药饮片厂生产）均购自广州中医药大学第一附属医院药房。

组分Ⅰ制备:南蛇藤和鸡血藤按组方配比，加5倍量80%乙醇加热回流提取2次，第1次2h，第2次2h(均80℃)，两次提取液回收乙醇，得浸膏，为组分Ⅰ，使用时加去离子水配成1∶1溶液。

组分Ⅱ制备:取南蛇藤，加5倍量80%乙醇加热回流提取2次，第1次2h，第2次2h(均80℃)，两次提取液回收乙醇，得浸膏①。取鸡血藤，加5倍量80%乙醇加热回流提取2次，第1次2h，第2次2h(均80℃)，两次提取液回收乙醇，得浸膏②。将①、②之浸膏合并，得组分Ⅱ，使用时加去离子水配成1∶1溶液。

组分Ⅲ制备：南蛇藤和鸡血藤按组方配比，加去离子水提取2次（第1次8倍量水2h，第2次5倍量水2h）,两次提取液合并，浓缩成1∶1提取液，为组分Ⅲ，备用。

1.2 动物 SD大鼠40只，雄性，SPF级，体重120~150g ,购自广东省医学实验动物中心，动物合格证号：粤监证字2005A010。

1.3试剂与仪器 弗氏完全佐剂(Freund＇s Adjuvant, Complete)，美国SIGMA公司产品；Rat IL-2试剂盒（LOT：20060904，EXP2007-03-04），Rat IL-6试剂盒（LOT：20060701，EXP2007-01-01），晶美生物工程有限公司出品；ELX800型酶标仪(BIO-TEK INSTRUMENTS,INC)；OLYMPUS CH-2显微镜；ZT-12H型生物组织自动脱水机；Y13-6型生物组织包埋机(湖北孝感亚光医用电子技术研究所)。

2 实验方法

2.1 动物实验取大鼠40只，随机分为5组，每组8只：分别为二藤提取液Ⅰ组、二藤提取液Ⅱ组、二藤提取液Ⅲ组，模型组（Ⅳ组）及正常组（Ⅴ组）。除正常组外，其余各组每只大鼠右后肢足跖皮内注射0.1mL弗氏完全佐剂，制作大鼠关节炎模型（AA模型）。造模后第15天开始分组灌胃给药，每日1次，给药剂量1mL/100g体重；模型组与正常组给予生理盐水。连续给药15天，每隔5天测量一次足体积，计算肿胀度（致炎足体积－未致炎足体积）。实验完毕每鼠眼眶取血3mL，分离血清，－20℃冷冻保存，待测细胞因子白介素2（IL-2）、白介素6（IL-6）；并取后肢关节做病理组织学检查。

2.2大鼠关节切片观察滑膜和软骨的病理改变评分标准 滑膜病理分级标准为：①炎性细胞浸润：无炎性细胞，计0分；稀疏散在，计1分；较密集，计2分；大量，计3分。②纤维组织增生：无纤维组织增生，计0分；少量增生，计1分；中等，计2分；大量，计3分。③滑膜细胞增生：无滑膜细胞增生，计0分；单层细胞肿胀密集，计1分；2层细胞肿胀密集，计2分；3层细胞肿胀密集，计3分。④巨噬样Ａ型细胞增生：无巨噬样Ａ型细胞，计0分；稀疏散在，计1分；较密集，计2分；大量，计3分。

软骨就破坏深度、破坏范围、破坏处纤维组织增生3个方面进行评价计分。分级标准：(1)软骨缺损深度：0级，无破坏；1级，表浅；2级，深达软骨层的1/2；3级，深达全层。(2)软骨缺损范围：0级，无缺损；1级，局灶性缺损；2级，缺损大于软骨面1/3而小于2/3；3级，缺损超过软骨面2/3。(3)纤维组织增生：0级，无纤维组织增生；1级，少量；2级，中等；3级，大量。

3实验结果

3.1对大鼠肿胀作用 二藤提取液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组均有减轻大鼠足肿胀作用，Ⅱ组作用较强。见表1。

3.2关节病理检查 二藤提取液Ⅰ组：关节面齿状浅缺损；二藤提取液Ⅱ组：关节面修复至全层2/3；二藤提取液Ⅲ组：关节面完整；模型组：关节面缺损，深达软骨全层及软骨下骨质，纤维组织增生显著；正常组：关节面光滑，软骨层完整。见图1～5。

3.3对大鼠关节滑膜病变的作用 二藤提取液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组均有减轻关节滑膜病变作用，Ⅲ组作用较强。见表2。

3.4对大鼠关节软骨病变作用 二藤提取液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组均有减轻关节软骨病变作用，Ⅱ、Ⅲ组作用较强。见表3。

4讨 论

南蛇藤属植物主要成分有生物碱、萜类、强心苷及黄酮类化合物[3-4]。其中一些化学成分具有昆虫拒食和抗肿瘤活性，南蛇藤素(celastrol)有抗氧化、抗炎活性[5]，而黄酮类化合物可作为一种环氧酶抑制剂，用于治疗风湿性关节炎。鸡血藤化学成分主要含黄酮、三萜和甾醇等多种成分[6]。药理研究表明，鸡血藤有抑制血小板聚集、降低血压、抗心率失常等作用[7]。根据上述，南蛇藤和鸡血藤的化学成分多为极性较大的脂溶性成分，故醇提制备组分Ⅰ；因二藤通痹合剂组方简单，故考察分提与合并提取的效果制备组分Ⅱ；而本院制剂二藤通痹合剂为水提制剂，故制备水提组分Ⅲ，以比较两种溶剂提取的不同。如此制备了二藤提取液的3种组分。

通过制作大鼠关节炎模型（AA模型），观察各组药物对AA大鼠足趾的消炎消肿作用，对后肢关节病理的影响，并检测血清细胞因子IL-2、IL-6含量，考察各组药物的抗类风湿作用。细胞因子是类风湿炎症和关节损伤的重要介质,它可能通过介导细胞与细胞之间的相互作用引起组织损伤酶的释放而导致关节损伤,特别是关节软骨基质崩解。结果显示，二藤提取液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组均对大鼠足肿胀有消炎消肿作用，并有减轻关节滑膜病变、减轻关节软骨病变作用，其中Ⅱ组作用较强；二藤提取液Ⅰ、Ⅲ组能降低AA大鼠血中IL-2、IL-6水平。综合结果显示组分直对各种指标均有较强作用，且组分Ⅲ为水提液，制备简单，故优选组分Ⅲ为最佳提取液。

参考文献

［1］ 刘晓玲，陈纪藩，邓健，等.二藤通痹合剂治疗类风湿性关节炎162例疗效观察[J].中药新药与临床药理,2005，16（4）：294-295.

[2] 刘晓玲，陈纪藩，邓健，等.二藤通痹合剂治疗强直性脊柱炎的临床研究[J].四川中医，2005，23（8）：65-66.

[3]张小娴.中药辞海•第一卷[M].北京：中国医药科技出版社，1999：2087.

[4]蒋毅.南蛇藤活性成分的研究[J].中草药，1996，27（2）：73.

[5] AllisonAC, CacabelosR, LombardiRM, et al. Progressinneuro psychopharmacology & biological psychiatry[J].Psychiatry,2001,25(7):1341-1357.

[6]林茂,李守珍,三川潮，等.密花豆藤化学成分的研究[J].中草药,1989，20(2):5-8.

[7]江涛.鸡血藤对大鼠主动脉环收缩反应的影响[J].广东药学院学报,1996,12(1):33-35.