银杏叶干燥方法的优化及其机制探讨
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[摘要] 为研究在不同干燥过程中银杏叶化学成分的变化规律，该文采用超高效液相色谱与三重四极杆质谱（UPLC-TQ/MS）联用技术，对银杏叶在自然晒干，阴干，35，45，60，80 ℃烘干过程中儿茶素类、黄酮及其苷类、双黄酮类、内酯类及酚酸类成分含量变化进行分析。结果表明80 ℃烘干条件下能起到“杀青”的作用，有利于银杏叶中儿茶素类、黄酮及其苷类、银杏内酯类等成分的转化积累，对双黄酮类成分含量影响不明显。可见80 ℃快速烘干法有利于银杏叶各类活性成分的保持，可为银杏叶药材的初加工工艺优化提供有益参考。
[关键词] 银杏叶；UPLC-TQ/MS；干燥方法优化；含量变化；机制探讨
银杏叶为银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.的干燥叶，秋季叶尚绿时采收。本品味甘、苦、涩，性平，归心、肺经，具有敛肺，平喘，活血化瘀，止痛的功效，主用于肺虚喘咳，冠心病，心绞痛，高血脂症的治疗。近代科学研究证明[1-2]，银杏叶中含有丰富的黄酮苷、双黄酮、银杏内酯等化学成分以及人体所需的营养元素。银杏叶中还含有银杏酚酸，而其中的银杏酸是主要毒性成分，属细胞毒素，可能与诱导机体突变和致癌有关，能引起皮肤、黏膜等处的过敏性炎症反应，皮肤接触它常引起漆毒样皮炎[3]。
产地加工是药材生产与品质形成的重要环节，其间发生着从非药用部位的去除、药效物质的最大保留、毒性成分的降低、化学成分间的相互转化等物理化学变化，最终目的是生产出优质药材，保障临床用药的有效性和安全性，如在丹参的干燥过程中，随着温度的升高，以丹酚酸B为代表的缩合酚酸含量不断下降，以丹参素、原儿茶醛为代表的小分子含量不断上升，并有新的小分子生成，这些酚酸之间存在相互转化此消彼长的关系[4]；当归在微波干燥条件下，当归多糖含量高于晒干、阴干、熏干等方法，且促进小鼠脾脏淋巴细胞增殖的效果最好[5]。但许多中药材采收后，各产地加工方法不一，干燥方法对质量的影响还缺乏研究。本文采用UPLC-TQ-MS联用技术，对银杏叶干燥过程中黄酮、内酯及酚酸类共24种成分含量变化进行了探讨，为银杏叶药材的产地初加工方法提供科学依据。
1 材料
Waters ACQUITY UPLC系统（包括四元泵溶剂系统，在线脱气机和自动进样器；Waters公司，Milford，USA）；Xevo TQ检测器（Waters公司）；MassLynx 4.1质谱工作站软件（Waters公司）；Pmb53型快速水分测定仪（德国Adam公司）；BT125型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；DHG-9240型鼓风干燥箱（杭州蓝天化验仪器厂）；EPED超纯水系统（南京易普达易科技发展有限公司）；KQ-250E型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；Anke GL-16GII型离心机（上海安亭科学仪器厂）。
化学对照品儿茶素（877-200001）、表儿茶素（878-200102）、槲皮素（1000861-200406）、山柰酚（110861-200304）、异鼠李素（110860-200406）、木犀草素（111520-200504）、银杏内酯A（110862-201009）、银杏内酯B（110863-200508）、银杏内酯C（110864-200906）、白果内酯（110865-200605）、白果新酸（111690-200702）、槲皮素 3-O-[6-O-（α-L-鼠李糖）-β-D-葡萄糖苷] （100080-200306）均购自中国食品药品检定研究院，表没食子酸儿茶素（39825）、芹菜素（22806）、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷（43089）购自上海晶纯有限公司，其余为本实验室从银杏叶中分离自制，其化学结构经1H，13C-NMR和ESI-MS分析确认，纯度经HPLC检测均大于98%。甲酸和乙腈均为色谱纯，分别购自德国Merck公司和美国Tedia公司；去离子水为经易普易达超纯水制备系统自制；其他化学试剂均为分析纯，购自上海国药化学试剂公司。
银杏叶样品于2012年7月采自南京中医药大学校园内，经南京中医药大学段金廒教授鉴定为银杏科植物银杏G. biloba的叶。标本存放于江苏省方剂研究重点实验室内。
将刚采摘成熟度相同新鲜银杏叶均匀分成6批，除去叶柄，经快速水分测定仪测得其含水量为70%。分别采用晒干，阴干，35，45，60，80 ℃烘干3种方法进行干燥处理，干燥过程中利用快速水分测定仪定时测定其水分，并在各条件下水分损失相当时取样，将样品切成直径约1 mm的碎块后匀浆或粉碎，存放于-80 ℃冰箱中备用。
2 测定方法
2.1 对照品溶液制备 精密称定干燥至恒重的对照品适量，加80%甲醇制成储备液，再分别吸取适量制成质量浓度分别为 （-）表没食子酸儿茶素3.2 mg·L-1（1）、（+）儿茶素2.4 mg·L-1（2）、（-）表儿茶素3.2 mg·L-1（3）、槲皮素-3-O-[6-O-（α-L-鼠李糖）-β-D-葡萄糖苷]4.96 mg·L-1（4）、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷3 mg·L-1（5）、白果内酯3.92 mg·L-1（6）、银杏内酯 C 3.84 mg·L-1（7）、槲皮素-3-O-α-L-（葡萄糖基-β-D-1，2-鼠李糖苷）5.92 mg·L-1（8）、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷4.16 mg·L-1（9）、银杏内酯 B 4.72 mg·L-1（10）、银杏内酯 A 3.32 mg·L-1（11）、木犀草素3.2 mg·L-1（12）、槲皮素3.76 mg·L-1（13）、芹菜素3.22 mg·L-1（14）、山柰酚3.44 mg·L-1（15）、异鼠李素3.44 mg·L-1（16）、穗花杉双黄酮2.64 mg·L-1（17）、去甲银杏双黄酮4.72 mg·L-1（18）、芫花素3.68 mg·L-1（19）、银杏双黄酮3.72 mg·L-1（20）、异银杏双黄酮4.2 mg·L-1（21）、金松双黄酮3.2 mg·L-1（22）、白果新酸4.16 mg·L-1（23）、银杏酸3.52 mg·L-1（24）的混合对照品储备液。取不同体积的上述储备液加甲醇稀释后，制成6份不同浓度的对照品溶液，用以线性关系考察。对照品溶液在注入液相色谱仪前经13 000 r·min-1，4 ℃离心10 min，取上清液过0.22 μm的微孔滤膜滤过。所有的对照品溶液均在4 ℃条件下贮藏。
2.2 供试品溶液制备 精密称定相当于0.5 g干品的各样品，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入20 mL 70%甲醇，静置10 h，室温超声提取30 min，加70%甲醇补足失重，摇匀。提取液离心，上清液经0.22 μm的微孔滤膜滤过后，取续滤液作为供试品溶液。
2.3 色谱分析条件 ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱 （2.1 mm×100 mm， 1.7 μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～7 min， 10%～35% B； 7～11 min， 35%～60% B； 11～14 min， 60%～100% B； 14～17 min， 100% B），优化后的色谱图见图1。流速0.4 mL·min-1，柱温35 ℃，进样体积1 μL。
2.4 质谱检测条件 离子化模式ESI-/ESI+；多反应监测（MRM） 方式；毛细管电压3.0 kV；离子源温度150 ℃；脱溶剂气温度550 ℃；脱溶剂气流量1 000 L·h-1；锥孔气流量50 L·h-1；碰撞气流量0.15 mL·min-1；各化合物的保留时间、取样锥孔电压及碰撞能量见表1。
3 结果
3.1 样品含量测定 通过与对照品比对保留时间及负离子模式下ESI-MS/MS信息对目标峰进行鉴定；利用峰面积与浓度方程计算出各个成分的含量。以不同干燥条件下水分损失量为横坐标，成分含量为纵坐标，绘制曲线图。
3.2 儿茶素类成分含量变化分析 （-）表没食子酸儿茶素、（+）儿茶素、（-）表儿茶素三者在各干燥条件下含量与鲜品相比，制干后均有不同程度的降低，其中80 ℃烘干损失最少，晒干条件下损失最多且趋势最明显，见图2，损失高达60%～90%，三者制干后含量均为80 ℃>60 ℃>45 ℃>35 ℃，阴干>晒干。
3.3 黄酮及其苷类成分含量变化分析 黄酮在银杏叶中含量较低，见图3，在0.24～28.44 μg·g-1，其中木犀草素、槲皮素、芹菜素和异鼠李素均在晒干条件下有较明显的上升趋势出现，与鲜品相比，制干后四者含量分别增加95.0%，162.5%，109.0%，13.5%，且在45，60 ℃烘干条件下也有利于4者成分的积累，山柰酚在鲜品中及阴干和80 ℃烘干条件下均未检测到，在其他条件下随着水分的减少含量从无到有并逐渐上升，而芫花素在制干前后含量基本一致。槲皮素3-O-[6-O-（α-L-鼠李糖）-β-D-葡萄糖苷]、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-[4-O-（β-D-葡萄糖）-α-L-鼠李糖苷]、槲皮素3-O-α-L-鼠李糖苷变化趋势基本一致，均呈先上升后下降的趋势，见图4。在80 ℃烘干条件下含量下降趋势较小，制干后含量高于鲜品或与鲜品相当。其他成分条件下制干后含量均有不同程度的降低。
3.4 双黄酮类成分含量变化分析 在80 ℃条件下，去甲银杏双黄酮和穗花杉双黄酮的含量呈先升高后降低的趋势，而制干后含量与鲜品差异不大，其他条件下干燥过程中含量均稳定或略有下降，可见较高温度干燥对这2种双黄酮含量影响起主导因素，见图5。银杏双黄酮、异银杏双黄酮两者的变化趋势相似，总体上呈先升高后降低的趋势，其中异银杏双黄酮在阴干，35，80 ℃干燥条件下，少量失水后含量升高近1倍，之后随着水分的不断减少含量逐渐降低，在60，45 ℃干燥条件下含量升高趋势较缓慢，但制干后含量却高于其他干燥方式，而对银杏双黄酮来说，80 ℃烘干和晒干能提高其含量。金松双黄酮在银杏叶中含量十分丰富，可达5 600～6 000 μg·g-1，其性质较稳定，在各干燥条件下含量基本保持平稳。
3.5 银杏内酯类成分含量变化分析 银杏内酯A，B，C及白果内酯变化趋势一致，呈先升高后降低的趋势，其中80 ℃和晒干趋势明显高于其他，且这4个内酯制干后含量均为80 ℃>晒干>阴干>60 ℃>45 ℃>35 ℃，见图6。
3.6 酚酸类成分含量变化分析 白果新酸在干燥前后含量变化较小，而银杏酸变化明显，除35，45 ℃时呈平稳下降趋势外，均呈先升高后降低的趋势，其中80 ℃条件下最为明显，见图7。
3.7 不同干燥条件的综合评价 由于银杏叶中各类成分在不同加工方式中变化不尽相同，故利用综合评价法以确定适宜的产地初加工方法[6]。以黄酮和内酯类成分含量与对应的组别组成矩阵，对其进行了主成分分析，结果前4个主成分的特征值均大于1，说明前4个因子在影响银杏叶质量评价的指标中起着主导作用，4个主成分的积累贡献率达95.35%，能够客观地反映银杏叶药材的内在质量，故选用前4个主成分对不同干燥方法的银杏叶进行综合评价。以各主成分因子得分与方差贡献率乘积之和相加，得出各类成分总因子得分值F，其综合评价函数如下。
按综合评价函数计算出不同样品的综合得分（F），并按其得分进行降序排序，见表2。银杏叶在80 ℃烘干条件下综合评价明显高于其他干燥方式，说明该干燥方法优于其他方法，更适用于银杏叶的干燥加工。
4 讨论
通过测定线性关系、LOD和LOQ、日内精密度和日间精密度、稳定性、重现性及准确度，对该UPLC-MS/MS方法进行了验证。结果表明，这24个成分在测定范围内均显示较好的线性关系（R2>0.993 1），其LOD和LOQ分别在0.05～3.47，0.15～11.15 mg·L-1；日内精密度、日间精密度、重复性、稳定性试验RSD均小于5.0%；加样回收率在95.0%～105.5%，其RSD均小于6.0%。表明该方法可以用于样品中这24个成分的含量测定。
研究表明，新鲜的植物材料中含有使次生代谢物分解的胞内酶，“杀青”是利用高温迅速破坏鲜药中的各类酶活性，抑制相应化学成分的酶促氧化反应及水解反应，有利于各类活性成分的保持[7]。儿茶素属黄烷醇类物质，是2-苯基苯并吡喃的衍生物，性质活泼，在酶的催化下易发生许多复杂的聚合、缩合反应[8]。3种儿茶素类成分在80 ℃烘干条件下均损失最少，60 ℃其次，可能是由于高温使氧化该类成分的胞内酶类失活，起到“杀青”的作用，使得银杏叶中的儿茶素类成分大部分得以保留，而其他条件下儿茶素类成分含量均有所下降，其中晒干损失最多，可能是该类成分发生了氧化或缩合，而光照能加速这类反应的进行[8-9]；槲皮素在晒干，60，45 ℃烘干条件下含量均呈明显上升趋势，与之对应的以槲皮素为苷元的4种糖苷在这3种干燥条件下含量呈下降的趋势，而在80 ℃干燥时却保持在1个较平稳的水平，说明适宜条件下少量糖苷在胞内水解酶的作用下发生水解，80 ℃时水解酶失活。由此可以推断另外4个苷元可能也存在这种变化，山柰酚的从无到有更印证了这点，而芫花素在银杏叶内不形成苷，不存在这种变化。另外值得注意的是，这些成苷的苷元在低温烘干或阴干条件下均有下降趋势，可见银杏叶中不仅有分解糖苷的酶，也存在分解苷元的酶。
研究表明[10]银杏中内酯的合成是通过经典的甲羟戊酸（mevalonate， MVA）途径与新近发现的2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸（2-C-methyl-D-erythritol-4-ohosphate， MEP）途径。在干燥过程中4种内酯均呈升高的趋势，可见在某一阶段可能发生了这一次生代谢过程，且高温和光照能加速该过程的发生，之后内酯又发生了分解或转化导致其含量下降，而具体过程还值得更深入地研究；银杏酸是银杏叶的主要毒性成分，其在80 ℃烘干少量失水条件下含量迅速上升33.9%，可能是由于在干燥前期胞内酶还未失活，在高温刺激下加速了某种次生代谢物的转化，之后银杏酸含量又在短时间内迅速下降41.1%，此时的酶已在长时间的高温环境下失活，而银杏酸本身具有较强的抗氧化活性，迅速被氧化致含量下降。而与鲜品相比，各干燥条件下银杏酸含量仅下降了7.5%～37.4%，可见干燥过程中并不能有效的去除银杏酸，故在使用中要注意银杏酸的脱除。
中药材产地初加工是关系到中药材质量的关键，加工目的是提高药效，利于包装、贮藏和运输，加工不当不但会引起药材变色、变质、霉烂，而且影响疗效。本实验综合评价表明：药用品质为80 ℃烘干>60 ℃烘干>45 ℃烘干>晒干>35 ℃烘干>阴干，可见80 ℃烘干也能起到“杀青”的作用，使得分解次生代谢物的胞内酶失活，有效地防止了胞内酶对有效成分的分解，有利于黄酮与内酯类活性成分的保留，并且80 ℃烘干条件下耗时短，仅需40 min，大大节约了时间，而晒干（3 d）和阴干（6 d）需要时间长，且受天气因素影响较大，有效成分降解较多。因此建议将80 ℃快速烘干作为银杏叶产地加工的方法。
[参考文献]
[1] 夏晓晖， 张宇， 郗砚彬， 等. 银杏叶化学成分研究进展[J]. 中国实验方剂学杂志， 2009， 15（9）： 100.
[2] VanBeek T A， Montoro P. Chemical analysis and quality control of Ginkgo biloba leaves， extracts， and phytopharmaceuticals[J]. J Chromatogr A， 2009， 1216（11）： 2002.
[3] 刘平平， 潘苏华. 银杏叶制剂中银杏酚酸研究进展[J]. 中国中药杂志， 2012， 37（3）： 274.
[4] 邓寒霜， 高宝云， 王新军， 等. 干燥方法对中药材丹参有效成分含量的影响[J]. 商洛学院学报， 2007， 21（2）： 54.
[5] 吕洁丽， 陈红丽， 段金廒， 等. 不同加工方法对当归多糖的影响[J]. 中国中药杂志， 2011， 36（7）： 846.
[6] 段金廒， 严辉， 钱大玮， 等. 药材适宜采收期综合评价模式的建立与实践[J]. 中草药， 2010， 41（11）： 1755.
[7] 段金廒， 宿树兰， 钱大玮， 等. 药材初加工“杀青”环节与药材品质形成的探讨[J]. 中药材， 2011， 34（1）： 1.
[8] 李大祥， 宛晓春， 杨昌军， 等. 茶儿茶素氧化机理[J]. 天然产物研究与开发， 2006， 18（1）： 171.
[9] 宛晓春. 茶叶生物化学[M]. 北京： 中国农业出版社， 2004： 14.
[10] 周春华，盛艳乐，赵大球，等. 银杏内酯的生物合成研究进展[J]. 中药材，2009，32（6）： 994.
Study on optimization of drying method and its
mechanism in Ginkgo biloba leaves
GUAN Han-liang， QIAN Da-wei*， DUAN Jin-ao*， REN Hao， QIAN Ye-fei， TANG Yu-ping， LIU Pei
（Nanjing University of Chinese Medicine， Jiangsu Key Laboratory for High Technology Research of Traditiona1 Chinese
Medicine Formulae， Nanjing 210046， China）
[Abstract] To provide a scientific evidence for the initial primary processing method， an ultra-high performance liquid chromatography combined with a triple quadrupole electrospray tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） was used to analyze the contents variation of catechins， flavonoids， flavonoid glycosides， biflavones， terpene lactones and phenolic acids during the process of drying in the sun， in the shade， and baked with 35， 45， 60， 80 ℃，respectively. The results show that drying in the 80 ℃ is conducive to the accumulation of catechins， flavonoid glycosides， terpene lactones， better than the effects of other procedures. Therefore， the fast drying at 80 ℃ is beneficial for the retention of various types of active ingredient of Ginkgo biloba， and this method could be applied as a preferably dry processing.
[Key words] Ginkgo biloba leaves； UPLC-MS/MS； the optimization of drying method； content change； mechanism
doi：10.4268/cjcmm20131321