基于早实核桃不同品种叶片组织结构的抗寒性划分
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摘 要: 为研究早实核桃品种的抗寒性，以14个早实核桃品种为试材，采用印迹法和石蜡制片技术观测了10项叶片组织结构指标，应用变异系数、相关分析和聚类分析对叶片组织结构指标进行了筛选，采用隶属函数对各品种的抗寒性进行了综合评价。结果表明，叶片厚度、气孔密度和栅/海比是影响抗寒性的主要叶片组织结构指标；14个品种抗寒性强弱排序为: 西林2号>契可>温185>强特勒>维纳>鲁光>吐来尔>辽核3号>辽核4号>西扶2号>中林5号>辽核1号>香玲>西林3号。抗寒性类型划分为5类: 西林2号为高抗寒类型；契可和温185为抗寒类型；强特勒、维纳、鲁光、吐来尔、辽核3号和辽核4号为中抗寒类型；西扶2号、中林5号和辽核1号为低抗寒类型；香玲和西林3号为不抗寒类型。
关键词: 早实核桃； 叶片组织结构； 抗寒性； 综合评价
中图分类号：Ｓ６６4．1 文献标志码：Ａ 文章编号：１００９－９９８０（２０12）０2－0205－０7
Cold resistance division based on leaf tissue structure of early-fruiting walnut cultivars
LIU Du-ling1， ZHANG Bo-yong1， PENG Shao-bing1，ZHU Hai-lan1，LIU Shu-ming2*， DU Ting1
（1College of Forestry， Northwest A& F University， Yangling， Shaanxi 712100 China； 2College of Science， Northwest A&F University， Yangling， Shaanxi 712100 China)
Abstract: To study cold resistance of early-fruiting walnut cultivars， 14 early-fruiting varieties were used as experimental materials， and 10 leaf tissue structure indexes were observed by using blotting methods and paraffin section methods. Leaf tissue structure indexes were screened via coefficient of variation， analysis of correlation and hierarchical cluster analysis， and comprehensive evaluation on cold resistance for each variety was done by subordinate function . The results showed that leaf thickness， stomata density and the ratio between palisade tissue and spongy tissue were the main factors related to the hardiness；the cold resistance for 14 cultivars was in order of Xilin No. 2>Chico>Wen185>Vina>Chandler >Liaohe No. 3> Tulare >Luguang>Liaohe No.4>Xifu No. 2>Zhonglin No. 5>Xiangling>Xilin No. 3>Liaohe No. 1；according to the cold hardiness， the cultivars could be divided into 5 groups: Xilin No. 2 with high cold resistance; Chico and Wen185 with cold resistance ; Chandler， Vina， Luguang， Tulare， Liaohe No. 3 and Liaohe No.4 with medium cold resistance；Xifu No. 2， Zhonglin No. 5 and Liaohe No.1 with low cold-tolerance; Xiangling and Xilin No. 3 without cold resistance.
Key words: Early-fruiting walnut； Leaf tissue structure； Cold resistance； Comprehensive evaluation
核桃（Juglans regia L.）是主要的干果和木本油料树种， 是我国重要的传统出口商品。核桃果实营养丰富，其营养价值和保健作用越来越为人们所认识。随着人们生活水平的不断提高，对核桃的需求量日趋增多，核桃栽培面积迅速扩大。但我国北方核桃产区普遍存在倒春寒、晚霜危害，使核桃雌、雄花芽、幼嫩新梢严重受冻，造成核桃产量大幅度降低甚至绝收[1-2]，严重地制约着核桃产量和经济效益的提高，进而影响核桃生产的发展。因此，研究核桃的抗寒性，对于今后核桃生产的发展具有重要的意义。我们对14个早实核桃品种进行叶片解剖结构观测比较，综合评价早实核桃不同品种的抗寒性，旨在为核桃抗寒品种选育、引种栽培及适栽区划分提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
试材为早实核桃14个品种: 西林2号、西林3号、辽核1号、辽核3号、辽核4号、西扶2号、中林5号、温185、香玲、鲁光、维纳、契可、吐来尔和强特勒，树龄5～7 a，环境条件、管理条件基本一致。
1.2 方法
1.2.1 采样及处理 于2009年7月16日在兴平市马嵬镇核桃良种采穗圃，每品种选择3个生长势基本一致的单株，在每单株树冠同方向、同部位摘取同一节位充分成熟的小叶5枚（共15枚）。每个品种取5枚叶片用于气孔观察，其余10枚以主脉中部为中心，切取1 cm×1 cm小块，FAA液固定，后保存于70%的酒精中备用。
1.2.2 石蜡制片及叶片解剖结构观测 采用石蜡切片法制片[3]，酒精梯度脱水，浸蜡包埋，用LeicaRM切片，切片厚度8 μm，番红-固绿双重染色，中性树胶封藏，制成装片。装片用Motic显微镜及Motic显微成像系统观察，20倍镜下照相。利用图像处理软件Photoshop CS 3.0按像素测定其叶片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度（单位: μm），计算栅/海比、细胞结构紧密度（CTR）和细胞结构疏松度（SR），所有测量数据均为30个视野的平均值。计算公式为:
栅/海比=栅栏组织厚度/海绵组织厚度
细胞结构紧密度（CTR）=栅栏组织厚度/叶片厚度×100
细胞结构疏松度（SR）=海绵组织厚度/叶片厚度×100
1.2.3 叶表皮制片及气孔观测 采用印迹法[4]制片，中性树胶封片。用Motic显微镜及Motic显微成像系统观察， 40倍镜下照相。利用图像处理软件Photoshop CS 3.0按像素进行测量，观测气孔长度（APL）和气孔密度（SD），每个观测指标值均为30个视野的平均值。
气孔长度（APL）――气孔器两个肾形保卫细胞结合处的长度（ μm）。
气孔密度（SD）――每个视野单位面积气孔器的个数（个/mm2）。
1.2.4 数据分析 数据分析采用Excel和 SPSS 17.0软件进行。
2 结果与分析
2.1 早实核桃不同品种叶片组织结构特征比较
2.1.1 早实核桃不同品种叶肉组织结构特征比较
叶片厚度常作为植物抗寒性指标之一，越厚则水分散失越慢，在寒冷的外界环境下可延缓叶片受低温的损害程度。由表1可看出，各品种叶片厚度254.17~364.15 μm，品种间叶片厚度差异极显著，不同品种叶片厚度由大到小依次为: 辽核1号>西林2号>强特勒>辽核4号>维纳>温185>鲁光>辽核3号>西扶2号>中林5号>吐来尔>西林3号>契可>香玲。
从核桃叶片横切面图可见（图版Ⅰ），各品种叶肉细胞有明显栅栏组织和海绵组织分化，为典型的异面叶。靠近轴面的栅栏组织细胞为长柱状，细胞间隙较小，细胞分层排列紧密且较规则。海绵组织细胞位于栅栏组织和下表皮之间，多为短柱状，相互连接成网，但排列密集程度各品种不一。栅栏组织细胞内含叶绿体数目较多，分布也比较均匀，海绵组织细胞内叶绿体数目相对较少。
从测定结果看出（表1），14个核桃品种的叶肉组织结构指标之间均存在极显著差异。早实核桃多数品种栅栏组织为2层（吐来尔、契可、强特勒为2～3层），第1、2层栅栏组织细胞排列紧密，第3层细胞排列相对疏松，与海绵组织区分不太明显。栅栏组织厚度117.5~160.4 μm，平均厚度为140.08 μm。温185栅栏组织厚度最大，在 160 μm以上，香玲和西林3号最小，不到120 μm。各品种海绵组织均排列疏松（图版Ⅰ）。海绵组织厚度89.10~162.80 μm，平均厚度为118.62 μm，西林3号海绵组织最厚，为162.80 μm，契可海绵组织厚度最小，海绵组织细胞排列明显比其他品种密集。
各品种栅/海比为0.90~1.49，契可栅/海比最大，为1.49，辽核1号最小，为0.90。CTR值为0.52~0.40，温185的CTR值最大，辽核1号最小。SR值为0.34~0.45，辽核1号SR值最大，契可最小。
2.1.2 早实核桃不同品种表皮组织结构特征比较
表皮是植物的保护组织，是植物抵御不良环境的屏障[5]。表皮包括上表皮和下表皮。由图版Ⅱ可知，早实核桃表皮均由单层细胞构成，其外被角质层，上表皮细胞扁平方形，排列紧密，下表皮细胞不规则，没有空隙。从测定结果表1看，早实核桃各品种叶片表皮特征各异。除辽核3号、西扶2号、温185、香玲外，其他品种的上表皮均厚于下表皮；各品种上、下表皮厚度差异极显著；上表皮厚度28.27~15.35 μm，辽核1号上表皮明显厚于其他品种，西林3号上表皮明显薄于其他品种；下表皮厚度21.17~11.49 μm，香玲下表皮最厚，西林3号最薄。早实核桃上表皮没有气孔分布，下表皮散生有大量气孔。气孔平置，为不定式， 卵圆形或长圆形。气孔器由2个肾形的保卫细胞构成，形状相似（图版Ⅱ）。各品种的气孔特征存在极显著差异（表1），早实核桃气孔器形小而密集，平均长度为32.84 μm，平均密度为227.30个・mm-2。西林2号和吐来尔气孔最长（在35.00 μm以上），辽核3号气孔最短（在 30.00 μm以下）。辽核1号和西扶2号的气孔密度最大（在290.00个・mm-2以上），西林2号和契可的气孔密度最小（在150.00个・mm-2以下）。
2.2 早实核桃品种抗寒性综合评价
2.2.1 叶片抗寒性组织结构指标筛选 只有选择彼此独立的、具有代表性的指标才能获得抗寒性评价的最优方案。对14个早实核桃10项叶片解剖结构指标进行聚类分析。
从图1可以看出，10项叶片组织结构指标聚为3类时，各类间的距离比较大，说明各类特点比较突出，相关性较小。第1类包括叶片厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度、叶片组织结构疏松度（SR）、上表皮厚度和气孔长度（APL）；第2类包括下表皮厚度和气孔密度（SD）；第3类包括栅/海比和叶片组织结构紧密度（CTR）。各类中典型指标的选择根据相关指数的大小确定，相关指数计算公式为:
R2i为每类中每个指标的相关指数，n为每类中指标个数，i=1，2，…n， r为同类中某指标与其他指标间的相关系数（表2）。指标的相关指数越大，代表性越强。
根据统计学原理，如果选入了叶片结构变异过小的指标，不仅不会使分析结果准确、合理，反而给分析带来不便。一般在一组指标中变异系数大的指标对分析结果具有重要意义。由表3知，第1类中，叶片厚度的相关指数最大，确定为该类的典型指标；第2类中，下表皮厚度与气孔密度相关指数相等，气孔密度变异系数，17.84%（表1）较大，故选气孔密度；第3类中，栅/海比和CTR相关指数相等（表3），但栅/海比的变异系数大，12.45%（表1），故选择栅/海比。
2.2.2 早实核桃不同品种抗寒性综合评价 对筛选的3项叶片抗寒性解剖结构指标（叶片厚度、气孔密度、栅/海比），应用隶属函数法，对早实核桃14个品种的抗寒性进行综合评价。隶属函数值计算公式为:
Uij式中表示i种类j指标的抗寒隶属函数值；Xij表示i种类j指标的测定值；Xjmim表示所有种类j指标的最小值；Xjmix表示所有种类j指标的最大值；i表示某个品种；j表示某项指标。如果某一指标与核桃抗寒性呈负相关， 则利用反隶属函数进行转换， 计算公式为:
根据此公式计算出各品种3项指标的平均隶属度，以平均隶属度评价早实核桃品种的抗寒性，平均隶属度越大，抗寒性越强。
按平均隶属度大小（表4），对早实核桃品种抗寒性强弱排序为: 西林2号>契可>温185>强特勒>维纳>鲁光>吐来尔>辽核3号>辽核4号>西扶2号>中林5号>辽核1号>香玲>西林3号。按照平均隶属度将14个早实核桃品种抗寒性划分为5类: 0.70~1.00为高抗寒类型（High Resistance， HR）， 有西林2号；0.60~0.69为抗寒类型（Resistance， R）， 有契可和温185；0.40~0.59为中抗寒类型（Middle Resistance， MR），有强特勒、维纳、鲁光、吐来尔、辽核3号和辽核4号；0.30~0.39为低抗寒类型（Lower Resistance， LR）， 有西扶2号、中林5号和辽核1号；0~0.29为不抗寒类型（Susceptible， S），有香玲、西林3号。
3 讨 论
关于植物形态组织结构与抗寒性的关系，早在1904年Blinn[6]就指出，可根据品种之间形态差异来区分其抗寒性。叶是植物抗寒最敏感的器官，有关叶片形态组织结构与抗寒性关系的研究在许多经济林树种[5，7-9]已有报道。一般认为，CTR 、SR和栅/ 海比是指示抗寒性强弱的重要指标。 CTR、栅/ 海比与抗寒性呈正相关，SR与抗寒性呈负相关[8-10]。本研究应用相关分析、变异系数和聚类分析从10项叶片解剖结构指标中选择出指示早实核桃抗寒性的3项指标: 气孔密度、叶片厚度和栅/海比。气孔密度作为抗寒性指标与李国华等[5]在澳洲坚果上的研究结果一致，栅/海比作为抗寒性指标与吴林等[7]在越橘、王奎玲等[9]在耐冬山茶上的研究结果一致，而叶片厚度作为抗寒性指标与前人[5，8]的研究结果不一致。李国华等[5]和彭伟秀等[8]认为，单一组织的数量（如叶片总厚度、栅栏组织厚度或海绵组织厚度） 往往会随样品所处生态条件和生理状态的不同而发生变化，没有一定的稳定性， 不能很好反映品种间抗寒性在遗传上的差异， 作为不同品种抗寒性的形态学指标可靠性不强。因此，叶片厚度作为早实核桃抗寒性指标还有待于进一步研究。
本研究应用隶属函数法，对14种早实核桃品种的抗寒性进行了综合评价， 其强弱排序为: 西林2号>温185>契可>维纳>强特勒>辽核3号>吐来尔>鲁光>辽核4号>西扶2号>中林5号>香玲>西林3号>辽核1号。根据平均隶属度将14个品种划分为5个抗寒类型。第1类为高抗寒类型，有西林2号；第2类为抗寒类型，有契可和温185；第3类为中抗寒类型，有强特勒、维纳、鲁光、吐来尔、辽核3号和辽核4号；第4类为低抗寒类型，有西扶2号、中林5号和辽核1号；第五类为不抗寒类型，有香玲、西林3号。
抗寒性是从植物形态解剖构造，水分生理生态特征及生理生化反应到组织细胞，光合器官乃至原生质结构特点的综合反映[11]。因此只有从其抗寒形态结构特征、抗寒生理生化特征及核桃的生长状况等方面，采用多指标综合评价，才能客观地反映核桃的抗寒性[12-13]。本研究利用筛选的3项叶片解剖结构指标对早实核桃抗寒性进行了初步评价，要准确评价核桃的抗寒性，还需结合抗寒生理生化指标，田间冻害情况及冻害后生长恢复情况等加以综合考虑。
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