“绿叶中色素的提取与分离”实验失败原因分析及改进方案
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“绿叶中色素的提取与分离”是高中生物学教材中的一个经典实验。本实验目的是通过有机溶剂无水乙醇提取绿叶中的色素；通过不同色素在层析液中的溶解度不同，随层析液在滤纸上的扩散速度不同而分离色素，使学生直观地认识绿叶中的四种色素及相应含量。
据以往教学经验，此实验学生能清楚看到4条色素带的很少，层析后的色素带无论从颜色还是从色带的宽度上都不尽人意，且层析后的色素带很不平行，实验成功率并不高。
1.实验材料选取不佳
某些绿叶含水量相对较大，冲淡了色素。例如菠菜，实验课前尽管叶片已凉干，但细胞内部的含水量相对较大，研磨后滤液中依然含有较多水分，而色素是脂溶性的，必然影响提取滤液的质量，从而影响滤液细线上色素的浓度，导致实验失败。
某些绿叶有机酸含量较高，破坏了色素。由于叶绿素性质很不稳定，当细胞破裂时，细胞液内有机酸中的氢可取代叶绿素中的镁而成为褐色的去镁叶绿素。虽然碳酸钙可中和有机酸，以防止去镁反应的发生，但如果有机酸的含量大于碳酸钙的中和作用，叶绿素依然被大量破坏。如空心菜、蕃薯叶研磨后都有明显的褐变现象。因此，要避免使用这类绿叶。另外叶绿素水解酶和空气中、绿叶中氧气的氧化作用也对叶绿素有一定的破坏作用。所以降低叶绿素水解酶的活性，快速完成此实验全过程对于减少叶绿素的破坏有一定作用。
2.其他影响因素
5克的绿叶加入10ml无水乙醇，经反复实验得知无水乙醇用量太多，导致提取的色素浓度过低，明显影响层析后的效果。教材提示的CaCO3和SiO2用量模糊，学生往往加太多，吸走了部分色素。研磨不充分，色素未能充分溶解到无水乙醇中。滤液细线画得次数不够且粗细不均，导致色素带淡且不平行。
综上所述，导致实验失败的原因多数为提取过程中色素的浓度受到了影响。
我校根据学生的主要失败原因，经过多年的实践-总结-再实践-再总结，在原教材的实验方案基础之上进行了以下几个方面的改进，改进方法简便易行，实验效果良好，有一定的实用和推广价值，供同仁们参考。
二、实验改进
1.实验材料的改进
我校通过多年的实践摸索，使用过教材推荐的菠菜，还陆续尝试用过芥菜、上海青、空心菜、七叶芯、葫萝卜叶、蕃薯叶、木耳菜等多种实验材料。通过实验失败原因分析，经过反复的实践，认为芥菜细胞内含水量相对较少；褐变反应不明显；叶肉组织发达，色素含量丰富，研磨过滤后的滤液浓稠，层析后的4条色素带最明显，效果最佳，上海青次之。
芥菜为十字花科植物，在我国栽培历史悠久，多分布于长江以南各省，北方也有播种，类型和品种很多。其含有丰富的胡萝卜素、叶绿素。现有反季节栽培，无论是上学期还是下学期开此实验课，均可在市场上买到。选择叶片肥厚、叶色深绿者为佳。表1是几种不同实验材料按教材实验操作方法步骤经层析液分离后的实验对比结果。
表1 不同实验材料的实验结果比较
2.实验方法步骤的改进
考虑到用来画滤液细线的滤液用量很少，我们把5克的绿叶适当增加到8克左右（已去主叶脉），10ml无水乙醇降至5ml，以增加色素的浓度。
为了尽量减少研磨时SiO2对色素的吸附，我们用白细河沙替换SiO2。细河起SiO2粉末较粗，具有不易吸附色素的优点。使用前将细河沙洗净、晒干，分装到细口瓶中备用。
为了能适当降低叶绿素水解酶的活性，并使绿叶得到充分研磨而释放色素，以及防止无水乙醇的挥发。我们采用绿叶冷藏、分次研磨分次加入的办法。具体操作步骤是：①将芥菜叶于研磨前先冷藏5-6分钟，再取6-8克芥菜叶于研钵中剪碎；②加入CaCO3 1/2平药匙，细河沙1/2平药匙，迅速充分研磨至泥状（控制CaCO3和细河沙的使用量，目的是减少对色素的吸附）；③往叶泥中加入5ml无水乙醇，再快速充分研磨至糊状，使色素充分溶解于无水乙醇中。再将研磨液用一层尼龙布过滤到最小号培养皿中，得到浓绿色的滤液，并迅速盖上培养皿盖。
教材用毛细吸管画滤液细线，易造成滤液细线画得不齐、不直，过粗，分离后的色素带易形成带峰、带谷，甚至部分色素带重叠。经反复实践，我们尝试使用了下列几种方法画滤液细线，分别做一比较。
用棉签画滤液细线是一种十分简便的画滤液细线方法。具体步骤是：先把已剪去两角的滤纸条距边缘1cm画线处对折，形成一条直的折线。每生发一支干燥、洁净的医用棉签，用棉签蘸取适量的色素。同时，用这一折线迅速在含有滤液的棉签上画一道细线，干后重复再画5-6次。这样画出的滤液细线较直，分离后的色素带几乎不出现带峰、带谷。缺点是留在滤纸条上的色素含量有限，导致形成的色带不明显。
用毛笔画滤液细线，即用毛笔蘸取滤液，在滤纸条横线上放一块三角尺，沿着三角尺画滤液细线，干后重复再画5-6次。优点是色素带较直，缺点是滤纸条上的色素含量较少，原因是毛笔吸附了部分色素，需重复多画几次。
用“印章法”画滤液细线，即用盖玻片的其中一边蘸取色素，迅速在剪去两角的滤纸条横线上用“印章法”印滤液细线。待干后，重复再印5-6次，以增加色素的含量。由于盖玻片几乎不吸附色素，因此，在画同样次数情况下，细线上的色素含量较多，层析后的各色素带颜色更鲜艳、明显，实验效果相对较好；缺点是滤液若蘸多了，滤液细线局部易画粗，导致色带出现带峰、带谷，需少量多次、耐心细致地画。但上述三种方法相比较之下，整体效果还是以用“印章法”画滤液细线要好。
实践证明，由于芥菜叶肉质，叶肉组织发达，用其做为“色素的提取与分离”实验的材料，符合实验材料经济易得、优质的原则，四条色素带清晰，颜色鲜艳，实验效果良好。通过低温冷藏绿叶，降低了酶的活性；用细河沙替换SiO2分次研磨，并控制好CaCO3和细河沙的用量，减少了对色素的吸附；降低无水乙醇使用量，从而保证了色素具有一定的浓度。用“印章法”画滤液细线，简便易行，较好地解决了滤液细线画得不细、不齐的问题，从而保证了色素能较平行地分离，呈现4条颜色不同，色带宽度不同的清晰色带，大大提高了实验的成功率，使学生获得了快乐而成功的学习体验。