银荆感冒颗粒抗甲型流感病毒的药效学研究

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摘要：目的：研究银荆感冒颗粒对甲型流感病毒的抑制作用。方法：体外接种甲型流感病毒鼠肺适应株于狗肾细胞(MDCK)，观察银荆感冒颗粒体外抗病毒作用；体内实验(1)：以甲型流感病毒鼠肺适应株滴鼻感染小鼠，观察14天，计算小鼠存活率及存活天数；体内实验(2)：以甲型流感病毒鼠肺适应株滴鼻感染小鼠。观察肺指数，病理改变等。结果：银荆感冒颗粒体外抗甲型流感毒ECso为3.24mg／mL。银荆感冒颗粒10g／kg和20g／kg剂量组可明显延长甲型流感病毒感染小鼠存活天数，降低死亡率；银荆感冒颗粒10g／kg和20g／kg剂量组可明显抑制肺指数值，抑制率分别为31.4％和29.1％。结论：银荆感冒颗粒对甲型流感病毒有一定的抑制作用。

关键词：银荆感冒颗粒；甲型流感病毒；体内外；抑制

中图分类号：R285.5　文献标识码：A　文章编号：1673-7717(2007)11-2304-03

流行性感冒是上呼吸道传染性极强的病毒感染性疾病，在呼吸系统中发病率占首位，可引起许多并发症，重者可引起死亡。笔者运用现代工艺，选用古方银翘散结合临床化裁而制成银荆感冒颗粒，作为本院院内制剂，在临床上取得了良好疗效。为了探索该颗粒剂治疗流行性感冒的机制，笔者选择与呼吸道有关的甲型流感病毒，以该病毒感染小鼠为药物评价模型，通过感染小鼠存活率、存活天数、肺指数值与肺病理变化为指标来评价药效，同时结合体外实验，来观察银荆感冒颗粒对甲型流感病毒引起的细胞病变的作用。

1 实验材料

1.1　实验用药及试剂

银荆感冒颗粒，江苏省中医院药剂科提供，批号：050424；利巴韦林注射液，华北制药集团有限公司，批号：050128；RPMIMedium 1640，GIBCO公司；胰蛋白酶，上海伯奥生物技术有限公司，批号：020602；HFPES，江苏科威技术服务有限公司，批号：H3375；磷酸氢二钠，南京化学试剂厂，批号051207；磷酸二氢钾，广西西陇化工厂，批号：04119；碳酸氢钠，上海虹光化工厂，批号：050622；新生牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司，批号：050827；青霉素，山东鲁抗医药股份有限公司，批号：8040613；链霉素，大连美罗大药厂，批号：040707；乙醚，南京试剂厂，批号：050628。

1.2　实验用仪器

C02培养箱(BB16)，Beracus公司，倒置显微镜(XSZ-D2)，重庆光学仪器厂；微孔滤器，上海医药工业研究院；细胞培养板，丹麦NUNC公司；净化工作台(SW-cJ-IF)苏州安泰空气技术有限公司；FA1004型电子分析天平，上海精科天平厂。

1.3　实验用病毒株及细胞株

甲型流感病毒A／PR8／34(H1N1)，购自中国预防医学科学院病毒所，病毒由江苏省中医院临床研究所药理实验室传代后-70℃低温冰箱保存备用；狗肾细胞(MDCK)，购自上海细胞所。

1.4　实验用动物

ICR小鼠，雌雄各半，体重13～16g，由南京青龙山动物饲养厂提供，合格证号：SCZK(苏)2001―0008。

2　方法

2.1　银荆感冒颗粒体外对甲型流感病毒的作用

2.1.1　MDCK细胞培养新购置的MDCK细胞，用0.25％的胰酶消化，然后加入含血清培养液适量，轻轻吹打均匀，按1:3比例进行分瓶传代。实验前则接细胞于96孔培养板中，培养24h后，用于实验。

2.1.2　病毒毒力测定将冻存的病毒液快速冻融后，按10稀释法稀释成10-1～10-9的不同稀释液，接种到MDCK细胞培养板中，每个浓度4个孔，每孔接种150μL病毒液，于5％CO237℃静置培养，同时设正常细胞对照，4个复孔，观察细胞病变情况，以CPE不再进展时，按Reed－Muench氏法计算病毒滴度，即该病毒的TCID50。CPE程度：-，无细胞病变；25％细胞病变；++，50％细胞病变；+++，75％细胞病变：++++，100％细胞病变。

2.1.3　银荆感冒颗粒最大无毒浓度实验银荆感冒颗粒(浸膏)，每毫升相当于4.9g药材，首先将原浸膏稀释成1g／mL，再用完全培养液稀释成100mg／mL，最后用完全培养液将其分别稀释成80、40、20、10、5、2.5mg／mL的不同浓度加入长成单层MDCK细胞的96孔培养板中，每个浓度4个复孔，每孔150μL同时设立正常细胞对照组，置培养箱中培养，观察细胞的生长情况，观察病变情况，以不出现细胞变暗、变圆、融合、脱落等病变的最大药物浓度为该药物的无毒性浓度。

2.1.4　银荆感冒颗粒TC50测定根据最大无毒浓度实验结果，将银荆感冒颗粒稀释成不同浓度，加入长成单层MD-CK细胞的96孔板，每个浓度4个复孔，1501μL／孔，同时设立正常的细胞对照组，置培养箱中培养，观察细胞的生长情况，观察病变情况，采用孙氏综合法计算该药物对细胞的TC50。CPE程度：-，无细胞病变；+，25％细胞病变；++，50％细胞病变；+++，75％细胞病变；++++，100％细胞病变。

2.1.5　银荆感冒颗粒对甲型流感病毒的作用 已长成单层的细胞接种剂量为100TCID50的病毒，置37℃、5％C02温箱孵育2h，弃去含病毒维持液，更换含不同浓度药物的维持液，置培养箱内培养。每天观察细胞形态，连续观察3天，记录CPE程度，同时设立正常细胞对照组、病毒对照组各4孔，采用孙氏综合法计算药物半数有效浓度(ECso)和治疗指数(11)。治疗指数(-11)=TCso／ECso。CPE程度：一，无细胞病变；+，25％细胞病变；++，50％细胞病变：+++。75％细胞病变；++++，100％细胞病变。

2.2　银荆感冒颗粒体内对甲型流感病毒的作用

2.2.1　病毒感染小鼠半数致死量(LD50)测定

2.2.2银荆感冒颗粒对甲型流感病毒感染小鼠死亡的保护作用取ICR小鼠120只，体重13g～16g，雌雄各半，随机分6组，每组20只：(1)空白对照组，等量生理盐水；(2)模型组，等量生理盐水；(3)利巴韦林组，75mg／kg；(4)银荆感冒颗粒I组，5g／kg；(5)银荆感冒颗粒Ⅱ组，10g／kg；(6)银荆感冒颗粒Ⅲ组，20g／kg。以上各组均灌胃给药，给药容量10ml／kg，每天1次，连续5天。于给药第2d各小鼠(除空白对照组外)在乙醚麻醉下，以血凝试验640以上的尿囊液给小鼠滴鼻感染，每鼠300,L(20个LD50致死量)观察感染后发

病及死亡情况，每日记录动物的死亡情况，连续2周。

2.2.3　银荆感冒颗粒对甲型流感病毒感染小鼠肺指数及病理的影响取ICR小鼠60只，体重13g～16g，雌雄各半，随机分6组，每组10只：(1)正常组，等量生理盐水；(2)病毒对照组等量生理盐水；(3)利巴韦林组，75mg／kg；(4)银荆感冒颗粒I组，5g／kg；(5)银荆感冒颗粒Ⅱ组，10g／kg；(6)银荆感冒颗粒Ⅲ组，20g／kg。以上各组动物均灌胃给药，灌胃容量10mL／kg，每天1次，连续5天。于给药第2天各组动物(除空白对照组外)在乙醚麻醉下，用增毒3次尿囊液滴鼻感染小鼠，每鼠30μL(20个LD50致死量)，实验前禁食不禁水，末次给药后，实验当日各组小鼠称重，脱颈椎处死解剖，观察肺部病变：取全肺称重，计算各鼠肺指数及肺指数抑制率，比较各组间差异。肺指数=小鼠肺重(g)／小鼠体重(g)×100％；肺指数抑制率=对照组平均肺指数一实验组平均肺指数／对照组平均肺指数×100％。并随机抽取10只鼠肺，用10％甲醛溶液固定，送做病理，作组织学检查。

2.3　统计方法

数据处理运用SPSS 13.0软件完成，组问比较采用单因素方差分析。

3　结果

3.1　银荆感冒颗粒体外对甲型流感病毒的作用

病毒毒力测定结果为了解甲型流感病毒在MDCK细胞中的毒力情况，确定体外抗病毒药效学试验中病毒的攻击量。根据所得数据，采用Reed-Muench法计算TCIDm为10-4-4.5。银荆感冒颗粒毒性实验测定结果为了解银荆感冒颗粒在MDCK细胞中的毒性作用，确定试验中药物剂量。根据所得数据，银荆感冒颗粒最大无毒浓度为20mg／mL；采用孙氏综合法计算TC50为26.94mg／mL。银荆感冒颗粒体外对甲型流感病毒有良好的抑制作用，其ECso为3.24mg／rnL。T1为8.31。

3.2　银荆感冒颗粒体内对甲型流感病毒的作用

(1)病毒感染小鼠半数致死量(LD50)滴定是为了了解甲型流感病毒感染小鼠的死亡情况，确定体内实验甲型流感病毒感染小鼠的量。按孙氏综合法计算LD50是10-1.9。

(2)银荆感冒颗粒对甲型流感病毒感染小鼠死亡的保护作用，结果见表1。

实验结果提示：银荆感冒颗粒10／kg和20／kg剂量可明显延长甲型流感病毒感染小鼠存活天数，降低死亡率，对甲型流感病毒感染小鼠死亡具有保护作用。

(3)银荆感冒颗粒对甲型流感病毒感染小鼠肺指数及病理的影响，结果见表2。

实验结果提示：银荆感冒颗粒10g／kg和20g／kg剂量组可明显抑制肺指数值，抑制率分别为31.4％和29.1％，提示银荆感冒颗粒具有减轻甲型流感病毒感染小鼠肺部病变的作用。

4　讨论

流行性感冒由流感病毒引起，目前，国际上防治流感的方法是接种减毒活疫苗和使用化学药物治疗，但由于流感病毒容易发生抗原变异，使疫苗保护作用效果受到一定限制，而使用的化学药物又有较大的不良反应，因此到目前为止还没有有效防治流感的方法口。中医认为流行性感冒是外感六淫，时行病毒所致。以风为主因，风为六淫之首，但在不同季节，往往与其它当令之时气相合而伤人。一般以风热为多见，银荆感冒颗粒由金银花、连翘、荆芥、板蓝根、防风和薄荷组成，是银翘散结合临床经验化裁而成，方中金银花味甘，性寒，连翘味苦，性微寒，甘苦相合为君药，既有辛凉透邪清热之效，又有芳香辟秽解毒之功；荆芥味辛，性温，助君药辛开皮毛而散邪，板蓝根苦寒助君药清热解毒，共为臣药；防风、薄荷加强辛散泄热。对风热感冒发热、咽痛、周身酸痛、咳嗽等症有良好的治疗作用。笔者通过体内外实验初步证实了银荆感冒颗粒确有抗甲型流感病毒的作用。