阿魏酸对坐骨神经结扎小鼠的镇痛作用:行为学和神经生化分析

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[摘要] 研究阿魏酸慢性给药的镇痛作用，初步探讨其作用机制。采用热觉过敏和机械超敏实验，观察阿魏酸慢性给药对坐骨神经结扎（CCI）小鼠的影响。应用神经化学检测方法，观察阿魏酸慢性给药对单胺递质和单胺氧化酶活性的影响。与正常组相比，CCI小鼠的热觉和机械性痛阈都显著降低，而阿魏酸（10，20，40， 80 mg・kg-1， po）能显著逆转这一现象。进一步深入研究发现造成这种结果的原因是阿魏酸能剂量依赖性地增加海马、额叶皮层和杏仁核的5-HT和NE水平，并能抑制脑内MAO-A的活性。阿魏酸具有镇痛作用，其机制可能与抑制脑内单胺氧化酶活性，进而增加脑内胺类神经递质有关。

[关键词] 阿魏酸；疼痛；单胺递质；单胺氧化酶

[收稿日期] 2013-04-23

[基金项目] 浙江省中西医结合学会科研项目（2012LY011）

[通信作者] *潘建春，教授，硕士生导师，Tel：（0577）86689982，E-mail：wenzhoupan2003@163、com 神经痛是神经科常见症状之一，其特征是对有害刺激过度响应（痛觉过敏）、对早前无害的刺激产生疼痛感（痛觉超敏）以及自发疼痛[1]。临床上有许多患者对于典型镇痛药（比如阿片类和非甾体类抗炎药）产生耐受性，因此寻找更为有效的镇痛药物显得尤为重要。而抗抑郁药（如去甲替林）和抗惊厥药（如加巴喷丁）虽然作为一线药物，但是却未能很好地减轻患者的神经痛症状，并且还伴有不良反应[2-3]。随着天然药物在精神病治疗中使用的越来越多，而且其具有多靶点、低毒的优点，因此，从天然植物中开发安全有效、毒副作用小、生物利用度高的天然药物用于镇痛成为这一领域的研究方向。

阿魏酸（ferulic acid，3-甲氧基-4-羟基肉桂酸），是植物界广泛存在的一种低毒酚酸，它是阿魏、川芎、当归、升麻、木贼等多种中药的有效成分之一，在细胞壁与多糖和蛋白结合，形成细胞骨架。由于结构中的酚羟基，其具有很强的抗氧化活性，对过氧化氢、超氧自由基、羟自由基、过氧化亚硝基都具有强烈的清除作用[4]。阿魏酸能增加抑凋亡基因（Bcl-2）表达，减少促凋亡基因（Bax）表达，从而抑制氧化损伤，起到抗氧化作用。阿魏酸能明显抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞白介素1β（IL-1β）的升高，表明其通过抑制炎症反应而发挥作用，维护缺血区域神经元的基本结构和功能。程斯[5]研究发现，氟桂利嗪与阿魏酸钠联用治疗偏头痛的效果较单用氟桂利嗪有效率高，表明阿魏酸具有一定的镇痛作用。而坐骨神经结扎（chronic constriction injury of sciatic nerve，CCI）模型是目前公认的神经病理性疼痛模型，因此本研究就阿魏酸对CCI模型小鼠行为学的影响来探讨阿魏酸的镇痛作用及其初步机制。

1 材料与方法

1、1 药品和试剂 阿魏酸、盐酸丙咪嗪、5-羟色胺（5-HT）、去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）、5-羟基异丁酸（5-HIAA）及二羟苯乙酸（DOPAC）均购于 Sigma 公司（美国）。阿魏酸（10，20，40，80 mg・kg-1）溶解于双蒸水，灌胃给药；丙咪嗪（imipramine，10 mg・kg-1）用双蒸水溶解，腹腔给药。

1、2 仪器 BS-11OS 型电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）；WH-966漩涡混合器（太仓市科教器材厂）；Bio-RAD 680酶标仪（美国伯乐公司）；Agilent 1100高效液相仪（美国Agilent公司）；ANTEC电化学检测器（荷兰安泰克公司）；64R超速冷冻离心机（BECKMAN COULTER公司）；RF-5301PC型荧光分光光度计（日本岛津公司）；JY92-2D超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；超低温保存箱（海尔公司）。

1、3 动物 雄性ICR小鼠64只，SPF级，体重25～30 g，由温州医学院动物中心提供，许可证号SCXK（浙）2010-0044。饲养条件：6 只/笼，室温（24±1） ℃，湿度（50±10）%，自然光照，昼夜节律，自由摄食饮水。所有动物适应环境5 d后开始实验，实验前禁食10 h，自由饮水。随机分成8组，分别为空白对照组、假手术组、CCI组[溶媒组、阿魏酸组（10，20，40，80 mg・kg-1）、丙咪嗪组（10 mg・kg-1）]，每组8 只动物。

1、4 CCI模型建立[6] 小鼠在戊巴比妥麻醉下，于右侧大腿中部切开，暴露坐骨神经，于坐骨神经干上用4-0铬制羊肠线结扎3道松紧适中的结，以不影响神经的血液循环为原则，每2道之间间隔1 mm，然后将链霉素洒在切口上，逐层缝合切口。假手术组仅暴露坐骨神经不作结扎。

1、5 热觉过敏的测定[7] 将小鼠静置于底部为玻璃板的透明小室中，静置30 min后，辐射热光源对准小鼠右足掌正中照射，记录缩足反应的潜伏期作为热痛阈。超过20 s仍无缩足反应停止照射以免造成组织损伤。

1、6 机械超敏的测定[8] 采用一系列的Von Frey 纤维细丝测定小鼠的机械性缩足阈值（mechanical withdrawal threshold，MWT）。将小鼠单独置于一带有金属筛网的有机玻璃箱（5 cm × 5 cm × 10 cm）内适应至少20 min，使用Von Frey 纤维细丝（0、16，0、4，0、6，0、8，1、0，1、4，2、5，3，4、6，6 g）刺激小鼠右后腿足底中部。当小鼠出现快速抬足远离细丝或舔足行为视为阳性反应，反之为阴性反应。首先从 1、0 g 开始测试，因为这是中间值。当阳性反应或阴性反应出现后，再给予相邻小一级力度或者相邻大一级力度的刺激，如此连续进行5次。每次刺激间隔30 s。

1、7 脑内单胺含量测定[9-10] 行为学测试结束后将小鼠断头取脑，迅速剥离全脑，分离出海马、额叶皮质和杏仁核，称重。每100 mg脑组织在200 μL冰冷0、4 mol・L-1高氯酸（溶液A）中超声匀浆。匀浆液避光放于冰上1 h，然后12 000 r・min-1 4 ℃离心20 min，丢弃沉淀。160 μL上清液加入至80 μL的溶液B（0、2 mol・L-1柠檬酸、0、3 mol・L-1磷酸氢二钾、0、2 mol・L-1 EDTA）。混合液避光在冰上孵育1 h，12 000 r・min-14 ℃离心20 min。20 μL的上清液直接加入到装有C18反相柱（4、6 mm×150 mm，5 μm）和电化学检测器（ESA CoulArray，Chelmstord，MA，USA）的高效液相中，流动相组成为125 mmol・L-1枸橼酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 4、3），0、1 mmol・L-1 EDTA，1、2 mmol・L-1辛烷基磺酸钠和16%甲醇。流速1、0 mL・min-1。脑组织中单胺及其代谢产物的含量以ng・g-1湿组织重表示。

1、8 单胺氧化酶测定[11-12] 脑组织称重后加入4 mL冰冷磷酸缓冲液（pH 7、8，0、05 mol・L-1）制成匀浆液。取组织匀浆液0、2 mL和20% Triton X-1000 4 mL加入到2、5 mL磷酸缓冲液中，再加入司立吉林（单胺氧化酶-B抑制剂）或氯吉林（单胺氧化酶-A抑制剂），溶液混合后37 ℃预孵育15 min，使酶和抑制剂充分反应。再加入30 μL二氢溴脲胺（底物，与单胺氧化酶反应生成4-羟基喹啉）至终浓度22 μmol・L-1，37 ℃下反应30 min，随后立即加入0、2 mL 5 mol・L-1高氯酸。1 500×g条件下离心15 min，把1 mol・L-1氢氧化钠2、5 mL加入至0、5 mL上清液中。用荧光光谱仪在激发波长315 nm和发射波长380 nm处，检测荧光强度。通过标准曲线，确定4-羟基喹啉浓度。采用Bradford法测定蛋白含量[13]。单胺氧化酶活性以nmol・h-1・mg-1表示。

1、9 数据统计 采用SPSS 16、0统计软件包进行统计学处理，数据以±s表示，药物作用以One-way ANOVA方法分析，组间差异（P

2 结果

2、1 阿魏酸对CCI小鼠热觉痛阈的影响 与对照组相比，假手术组小鼠的热觉痛阈没有显著变化，而CCI组小鼠的热觉痛阈显著降低（P

与对照组相比1）P

图1 阿魏酸对对CCI小鼠热觉痛阈的影响（ ±s，n=8）

Fig、1 The effect of ferulic acid on the latency of thermal hyperalgesia test in CCI mice（±s，n=8）

2、2 阿魏酸对CCI小鼠机械痛阈的影响 与对照组相比，假手术组小鼠的机械痛阈没有显著变化，而CCI组小鼠的机械痛阈显著降低（P

图2 阿魏酸对CCI小鼠机械疼痛的影响（±s，n=8）

Fig、2 The effect of ferulic acid on the force of mechanical allodynia test in CCI mice（±s，n=8）

2、3 阿魏酸对CCI小鼠不同脑区单胺递质及其代谢产物的影响 与对照组相比，假手术组小鼠海马、额叶皮层和杏仁核中单胺递质及其代谢产物都没有明显改变，而CCI小鼠这3个脑区的5-HT和NE的含量显著降低，5-HT转换率明显升高，DA，DOPAC和5-HIAA水平无明显变化。在给予阿魏酸（10，20，40，80 mg・kg-1）或丙咪嗪（10 mg・kg-1）之后，5-HT和NE含量都呈现不同程度地上升，尤其是40，80 mg・kg-1剂量的阿魏酸和丙咪嗪；5-HT转换率在此3个脑区中有显著的下降趋势（表1～3）。

2、4 阿魏酸对CCI小鼠单胺氧化酶的影响 与对照组相比，假手术组小鼠无论是单胺氧化酶A还是B都没有明显变化，CCI组小鼠的单胺氧化酶A含量显著增加。给予阿魏酸（10，20，40，80 mg・kg-1）后，小鼠全脑单胺氧化酶A（司立吉林处理组）活性抑制率分别是6、8%，12、7%，18、7%，24、7%。吗氯贝胺（20 mg・kg-1， po）抑制了25、1%的单胺氧化酶A的活性，对单胺氧化酶B的活性没有明显影响。而丙咪嗪（10 mg・kg-1）对单胺氧化酶没有影响（表4）。3 讨论

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Analgesic effect of ferulic acid on CCI mice： behavior and

neurobiological analysis

LV Wei-hong1， ZHANG Lu2， WU Shu-juan3， CHEN Sai-zhen2， ZHU Xin-bo3， PAN Jian-chun3*

（1、 Department of Pharmacy， Wenling traditional Chinese medical hospital， Taizhou 317500， China；

2、 Department of Pharmacy， Taizhou Central Hospital， Taizhou 318000， China；

3、 Department of Pharmacology， Wenzhou Medical University， Wenzhou 325035， China）

[Abstract] To study the analgesic effect of chronic administration with ferulic acid， and preliminarily discuss its mechanism、 Thermal hyperalgesia and mechanical allodynia tests were conducted to observe the analgesic effect of chronic administration with ferulic acid on CCI mice、 The neurochemical detection method was applied to observe the effect chronic administration with ferulic acid on monoamine neurotransmitter and monoamine oxidase activity、 Compared with the normal group， CCI mice showed notable reduction in heat sensation and nociceptive threshold in and mechanical allodynia、 Ferulic acid （10， 20， 40 and 80 mg・kg-1， po） could significantly reverse the situations、 In an in-depth study， we found that the reason for these results was that ferulic acid was dose-dependent in increasing 5-HT and NE levels in hippocampus， frontal cortex and amygdale and could inhibit MAO-A activity in mouse brains、 These results showed that ferulic acid has the analgesic effect、 Its mechanism may be related to the inhibition of monoamine oxidase activity and the increase in monoamine neurotransmitter in mouse brains、

[Key words] ferulic acid； pain； monoamine neurotransmitter； monoamine oxidase

doi：10.4268/cjcmm20132126