当归多糖联合阿糖胞苷诱导人白血病KG1α细胞株衰老的实验研究
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[摘要] 作者实验室最新研究发现，当归多糖（Angelica sinensis polysaccharides，ASP）对延缓造血干细胞衰老有明确的调控作用。白血病是一种造血干细胞水平的恶性血液肿瘤，ASP对白血病细胞有无调控衰老的作用却未见相关报道。该研究以对数生长期人急性髓系白血病（acute myeloid leukemia， AML）细胞株KG1α为研究对象，将其分为当归多糖组（ASP组），阿糖胞苷组（Ara-C组），当归多糖与阿糖胞苷联合组（ASP+Ara-C组）和对照组，分别加入不同浓度的ASP，Ara-C和ASP+Ara-C，作用不同时间，旨在研究当归多糖联合阿糖胞苷诱导人白血病细胞株kg1α衰老的作用及其相关机制。结果显示，ASP，Ara-C，ASP+Ara-C在体外能明显抑制KG1α细胞增殖，使细胞阻滞于G0/G1期；细胞呈现衰老形态学特点；衰老染色阳性细胞率显著增高；并能显著上调衰老相关蛋白P16与RB的表达， ASP+Ara-C组的上述指标更加显著。综上所述， ASP与Ara-C诱导KG1α细胞衰老的机制可能与调控衰老相关蛋白的表达有关，提示ASP与抗肿瘤药物联合用药在白血病治疗中可起到更好作用。
[关键词] 当归多糖；白血病；KG1α细胞；衰老
当归多糖（Angelica sinensis polysaccharides， ASP）是祖国医学“补血”要药当归的重要药效成分。本课题组既往工作和其他学者的工作证明，ASP对机体的免疫系统和造血系统有明显的促进作用，抗肿瘤和抗辐射损伤也显示良好的功效[1-4]。传统中医理论认为某些中药及其有效成分有“双向调控”作用，即对正常组织细胞和异常组织细胞的作用存在差异。本课题组最近研究发现，ASP对延缓造血干细胞衰老有明确的调控作用[5-6]。白血病是造血干细胞水平的恶性血液系统肿瘤，ASP是否对白血病细胞有诱导衰老的作用是值得探讨的科学问题。本研究以人急性髓系白血病KG1α细胞株为研究对象，研究ASP与Ara-C诱导人白血病细胞株衰老的作用及其相关机制，旨在为探讨天然药物有效成分调控肿瘤细胞衰老提供实验依据，为白血病等肿瘤的治疗提供新的思路和方法。
1材料与方法
1.1细胞株 KG1α细胞株由重庆医科大学临床检验医学院惠赠，在含10%胎牛血清的1640培养体系、37 ℃，5%CO2的恒温培养箱中培养，每隔2～3 d换液传代1次。
1.2药品、试剂与配制 ASP购自陕西慈缘生物技术有限公司（批号CY130421，甘肃岷县当归提取，纯度≥95%），1640培养液配制成所需浓度；Ara-C购自国药一心制药有限公司（国药准字H20055127，相对分子质量279.68），1640培养液配制成所需浓度。RPMI-1640培养基（Hyclon公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；CCK-8（上海七海复泰生物科技有限公司）；Wright′s染液（本实验室配制）；衰老相关-β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色试剂盒（碧云天生物技术研究所）；P16兔多克隆抗体（安博生物技术有限公司），β-actin鼠多克隆抗体、RB兔多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠抗体、山羊抗兔抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）。
1.3细胞分组与增殖抑制率检测 取对数生长期的KG1α细胞分为：ASP组，培养体系中加入0.5～3 g·L-1的ASP；Ara-C组，培养体系中加入0.05～0.25 g·L-1的Ara-C； ASP+Ara-C组，同时加入1～2 g·L-1的ASP和0.08～0.16 g·L-1的Ara-C；对照组，加入等量的培养液。调整细胞密度为5×107个/L，以每孔200 μL的培养体系接种于96孔板，每个浓度分设3个复孔，同时设立无细胞的空白对照组。各组置37 ℃，含5%CO2的孵箱中培养24，48，72 h，加入20 μL的CCK-8继续培养4 h，酶联免疫检测仪测定各孔A450，细胞增殖抑制率=（A对照组-A实验组）/（A对照组-A空白对照组）×100%。
1.4流式细胞术分析细胞周期各时相分布 分别收集培养48 h的对照组（常规培养）、ASP组（终浓度2 g·L-1）、Ara-C组（终浓度0.16 g·L-1）、ASP+Ara-C组（ASP 2 g·L-1+Ara-C 0.16 g·L-1）KG1α细胞1×105个，PBS洗涤2次，用70%冷乙醇4 ℃固定过夜。测定前将固定液遗弃，加入碘化丙啶和RNA酶工作液，在4 ℃染色处理30 min，用300目滤网过滤后上流式细胞仪，经计算机数据处理，分析得出细胞周期的各时相比例。
1.5SA-β-Gal染色分析细胞衰老 收集细胞同1.4项方法，PBS洗涤2次，按试剂盒说明书操作。甘油封片镜检，将各组随机计数的400个细胞中的阳性细胞数，计算阳性细胞率（%）。
1.6Wright′s染色观察细胞衰老形态学 收集细胞同1.4项方法，PBS洗涤2次，离心涂片后进行Wright′s染色，光镜下观察细胞衰老形态。
1.7Western blotting检测P16，RB蛋白的表达 收集细胞同1.4项方法，PBS洗涤，蛋白裂解液裂解提取蛋白，BCA法测定细胞总蛋白浓度，SDS-PAGE电泳分离。一抗（参照说明书稀释抗体）4 ℃过夜，二抗37 ℃1 h，ECL发光。Quantity-One软件分析，目的蛋白表达量用目的条带与β-actin条带的灰度值比值表示。
1.8统计学分析 采用SPSS 16.0统计软件进行单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，计量资料以±s表示，以P
2结果
2.1ASP与Ara-C对KG1α细胞增殖抑制的影响 随ASP浓度增加和时间的延长，对KG1α细胞增殖抑制作用逐渐增强，IC50软件计算得出48 h时ASP的IC50为1.78 g·L-1（图1）。Ara-C对KG1α细胞抑制和药物浓度与作用时间呈正相关，IC50为0.15 g·L-1（图2）。ASP（2 g·L-1）和Ara-C（0.16 g·L-1）联合用药比ASP（1 g·L-1）和Ara-C（0.08 g·L-1）联合用药效果好（图3）。
2.2ASP与Ara-C对KG1α细胞周期的分布影响 2 g·L-1的ASP，0.16 g·L-1的Ara-C，2 g·L-1 ASP加0.16 g·L-1的Ara-C作用KG1α细胞48 h，均出现G1期阻滞，G0/G1期比例显著升高、S期比例显著降低，其中Ara-C组与ASP+Arc-C组更加明显（P
2.3ASP与Ara-C作用对KG1α细胞的形态改变 对照组KG1α细胞体积大小不等，核大而明显，核浆比例高，胞浆少数有空泡。2 g·L-1的ASP，0.16 g·L-1的Ara-C，2 g·L-1 ASP加0.16 g·L-1的Ara-C作用KG1α细胞48 h，可见细胞体积变大，核发生固缩，核浆比例减小，部分细胞胞浆空泡增多，可见细胞膜与核膜溶解的退化细胞（图4）。
2.4ASP与Ara-C作用对KG1α细胞SA-β-Gal染色阳性率的影响 SA-β-Gal染色显示阳性细胞胞质呈蓝绿色，阴性细胞未着色。对照组，2 g·L-1的ASP，0.16 g·L-1的Ara-C，2 g·L-1的ASP+0.16 g·L-1的Ara-C作用48 h，SA-β-Gal阳性率分别为（7.19±2.55）%，（30.50±2.78）%，（36.63±3.53）%，（56.97±4.89）%。加药组与对照组相比能显著提高KG1α细胞SA-β-Gal阳性率（图5，P
2.5ASP和Ara-C作用对KG1α细胞P16，RB蛋白的表达 2 g·L-1的ASP，0.16 g·L-1的Ara-C，2 g·L-1的ASP+0.16 g·L-1Ara-C作用48 h，能显著上调P16蛋白与RB蛋白的表达（P
3讨论
白血病是一种造血干细胞水平的血液系统的恶性肿瘤。迄今，治疗白血病的方式仍主要是采用大剂量联合化疗，但这种治疗方式对机体免疫系统和造血系统破坏极大，对全身各组织器官的损伤也十分严重，最终病人往往死于化疗所致全身衰竭。
如果能寻找到诱导白血病细胞衰老，调控其凋亡的天然诱导剂，这将为白血病等肿瘤的治疗带来新的途径。
ASP是中医临床“补血、活血”要药当归的主要药物活性成分之一，传统中医理论认为，某些中药及其有效成分有“双向调控”作用，即对正常组织细胞和异常组织细胞的作用存在差异。本课题组最新研究发现，ASP可能是当归抗衰老的有效成分，它能延缓造血干细胞衰老[5-6]。中医学理论认为，白血病属于“虚劳”、“血虚”等范畴，以气血两虚多见，因虚致病，血虚日久，气血运行不畅，因虚致瘀，临床以血虚证和血瘀证为主。ASP是否对白血病细胞有诱导衰老的作用是值得探讨的科学问题。本研究以人急性髓系白血病KG1α细胞株为研究对象，研究ASP与Ara-C诱导人白血病细胞株衰老的作用及其相关机制，旨在为天然药物的有效成分调控肿瘤细胞的衰老提供实验依据，为白血病等肿瘤的治疗提供新的思路和方法。
本实验结果证明，ASP与Ara-C均能够明显抑制KG1α细胞增殖，呈剂量和时间依赖性，ASP与Ara-C联合用药抑制作用更显著。本课题组既往研究证明[5-8]，ASP对造血干细胞增殖分化有促进作用，并能延缓造血干细胞衰老，结果说明当归多糖对正常造血细胞和白血病细胞确有“双向调控”作用。研究结果提示，ASP与抗肿瘤药物联合治疗肿瘤既有协同抑制肿瘤作用，也能减轻抗肿瘤药物对骨髓的损伤作用，本研究为中西医联合治疗白血病提供了理论支持与实验依据。
衰老相关β半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性能反映细胞溶酶体的数量和功能状态，衰老细胞溶酶体的酶活性降低，但由于不断积累的各种损伤刺激需要通过细胞的溶酶体进行代谢，因此衰老细胞内溶酶体虽然清除衰老细胞器的能力减弱，但数量和体积反而增加，SA-β-gal的表达水平增高[9-10]。因此，SA-β-Gal染色是经典和公认评价细胞衰老的生物学指标，而衰老细胞形态学观察是客观指标，本研究结果表明，ASP，Ara-C，ASP+Ara-C作用48 h，KG1α细胞的SA-β-Gal阳性率升高，细胞表现为体积变大，核发生固缩，部分细胞胞浆空泡增多等衰老形态学变化，联合用药的更为明显。提示ASP，Ara-C单用或联合应用都可以促进白血病细胞衰老。这为临床上通过药物诱导肿瘤细胞衰老达到治疗肿瘤目的提供了新思路。
研究表明，细胞周期G1期的关卡是细胞衰老的关键调控点，而P16在该调控点发挥重要作用，它能特异地与CDK6结合，阻止Cyclin D/CDK6的形成，使Rb蛋白低磷酸化，从而使Rb正常地行使G1期阻滞功能，导致细胞不可逆地停滞于G1期，以维持细胞衰老的特征性改变[11-12]。本研究结果表明，ASP，Ara-C，ASP+Ara-C作用48 h，KG1α细胞均出现G1期阻滞，G0/G1期比例显著升高、S期比例显著降低，其中Ara-C组与ASP+Arc-C组更加明显。蛋白印迹结果显示，ASP，Ara-C，ASP+Ara-C作用48 h，P16与RB蛋白表达水平显著增加，提示ASP与Ara-C可能通过上调这2种蛋白的表达，从而引导细胞不可逆地停滞于G1期，最终使细胞进入衰老状态。
综上所述，ASP与Ara-C可抑制人急性髓系白血病KG1α细胞株增殖，并诱导其发生衰老改变，其机制可能与调控细胞周期基因的表达有关。
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Experimental study on aging effect of Angelica sinensis polysaccharides
combined with cytarabine on human leukemia KG1α cell lines
XU Chun-yan， GENG Shan， LIU Jun， ZHU Jia-hong， ZHANG Xian-ping， JIANG Rong， WANG Ya-ping*
（Department of Histology and Embryology， Laboratory of Stem Cells and Tissue Engineering，
Chongqing Medical University， Chongqing 400016， China）
[Abstract] The latest findings of our laboratory showed that Angelica sinensis polysaccharide （ASP） showed a definite effect in regulating the aging of hematopoietic stem cells. Leukemia is a type of malignant hematopoietic tumor in hematopoietic stem cells. There have been no relevant reports about ASP′s effect in regulating the aging of leukemia cells. In this study， human acute myeloid leukemia （AML） KG1α cell lines in logarithmic growth phase were taken as the study object， and were divided into the ASP group， the cytarabine （Ara-C） group， the ASP +Ara-C group and the control group. The groups were respectively treated with different concentration of ASP， Ara-C and ASP+Ara-C for different periods， with the aim to study the effect of ASP combined with Ara-C in regulating the aging of human acute myeloid leukemia KG1α cell lines and its relevant mechanism. The results showed that ASP， Ara-C and ASP+Ara-C could obviously inhibit KG1α cell proliferation in vitro， block the cells in G0/G1 phase. The cells showed the aging morphological feature. The percentage of positive stained aging cells was dramatically increased， and could significantly up-regulate the expression of aging-related proteins P16 and RB， which were more obvious in the ASP+Ara-C group. In conclusion， the aging mechanism of KG1α cell induced by ASP and Ara-C may be related to the regulation of the expression of aging-related proteins， suggesting that the combined administration of ASP and anticancer drugs plays a better role in the treatment of leukemia.
[Key words] Angelica sinensis polysaccharides； leukemia； KG1α cell； aging
doi：10.4268/cjcmm20140722