多药耐药蛋白P-糖蛋白的研究进展
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肿瘤细胞对化疗药物的耐受性是肿瘤治疗的主要障碍，也是多数肿瘤患者预后不佳的主要原因。有学者认为90%以上恶性肿瘤患者死亡在不同程度上与耐药因素有关[1]。肿瘤产生耐药与多种因素有关，如多药耐药基因的过度表达；谷胱甘肽解毒酶系统活性增高；DNA拓扑异构酶Ⅱ活性增高或性质发生改变；多药耐药相关蛋白基因表达增高等。其中由p-糖蛋白介导的多药耐药最为重要，本文重点介绍与P-糖蛋白有关的多种调控因素及其逆转多药耐药（multi resistance,MDR）进展。
1 P-糖蛋白的结构与功能
P-糖蛋白又称P-gp(p-glycoprotein),P-170，是由多药耐药基因(MDR1)编码的分子量为170 KD的糖蛋白，是Biedler于1970年发现的，Juliano于1976年首次命名的与肿瘤多药耐药有关的一种膜糖蛋白。人MDR1基因的cDNA全长4669 bp，其中第179~3840 bp之间为一个开放读框，起始密码为ATG，编码含有1280个氨基酸残基的多肽链，分子量约为140 KDa。该多肤链可以分为两个大致相同的同源部分，每部分含有6个穿膜的螺旋结构(疏水区)和一个胞内亲水结构域。12个疏水区在膜内排列成6对，使P-gp多肽链嵌于细胞膜内。在胞膜外侧P-gp有3个N连接的糖基化位点，翻译后修饰加上去的糖链约为30 KDa，使得成熟的P-gp分子量为170 KDa。在细胞膜内侧，P-gp的两个亲水结构域各含一个ATP结合位点，分别在第426-433/541-551和1068-1075/1184-1196氨基酸残基之间[2]。
关于P-gp功能单位，有学者提出“疏水真空清除器”(hydrophobic vacuum cleaner)模式，认为P-gp本身形成单一药物通道，具有药泵功能，并可在细胞内控测药物浓度，当药物进入细胞后，P-gp结合药物分子，同时其ATP位点结合ATP后释放能量使药物转移到细胞外，也可以直接从细胞膜排除药物，使细胞内药物浓度始终维持于低水平，细胞由此获得耐药性[3]。P-gp对药物的特异性很小，因此MDR细胞能对许多结构和作用机制不同的药物产生耐药。这些药物常具有较大的分子量，多呈脂溶性，能被动扩散进入细胞，易与P-gp结合，如阿霉素、长春新碱等许多脂溶性抗癌药。有学者研究表明钙调蛋白抑制剂及其他钙通道阻滞剂如nicardine可与P-gp结合，提高药物的细胞毒作用。这种作用是由于抑制了药物的外流，提高了细胞内的药物浓度，增加MDR细胞对抗癌药物的敏感性。因此有人推测，P-gp可能是钙离子通道的一部分，这也是钙离子拮抗剂作为化疗增敏剂的作用原理。目前大多数学者认为单分子P-gp就是一个功能单位，而westiein认为P-gp在膜内是以二聚体和四聚体方式存在的，以形成一个畅通的药物通道。
2 P-糖蛋白的分布与调控
P-gp分布于人的正常肝脏、肾脏和成人的肾上腺、胰腺、结肠、空肠，在孕妇的子宫分泌上皮腔和人胎盘中也有较高表达，在CD34+的多能祖干细胞中也有一定水平的P-gp表达。MDR1基因的表达受祖干细胞分化水平的形响，最原始的造血干细胞P-gp表达最高[4]。这说明P-gp并非是一种异常蛋白，它是人体内一种具有重要生理功能的转运蛋白，主要涉及正常组织的解毒、体内毒性物质的清除、激素的分泌、某些物质的转运以及参与正常组织细胞抵御外源性毒素损伤等。正常人体组织中，P-gp的表达存在着明显的个体差异性，即使是在同一组织中，P-gp的表达也有明显的异质性。不同组织来源的肿瘤中P-gp的表达水平有明显差别。来源于MDR1高表达组织的恶性肿瘤继续高表达MDR1基因，如结肠癌、肾细胞癌、肝细胞癌、肾上腺癌、嗜铬细胞瘤，胰腺癌、具有神经内分泌特征的非小细胞肺癌等。这些肿瘤在治疗前就高表达P-gp，因此对抗肿瘤药物具有天然耐药性。而许多未经治疗的肿瘤中mdr1 mRNA和P-gp的表达水平非常低，甚至不能检出，这类肿瘤主要包括非小细胞肺癌、食道癌、胃癌、前列腺癌、肉瘤等。乳腺癌、卵巢癌、非何杰金氏淋巴瘤、儿童急性淋巴细胞性白血病等开始对化疗药物敏感，但在化疗过程中或化疗结束后，其P-gp水平常显著增高而表现出获得性MDR[5]。在临床上，MDR1基因及P-gp的表达水平可用以判断肿瘤患者的预后。
P-gp的表达受多种因素多种形式的调控。①通过MDR1 mRNA和P-gp水平增高，此时可以没有MDR1的扩增。Hu[6]等选择一株MDR1 mRNA和P-gp低表达的细胞系CEM/A7R，接触柔红霉素24 h内，MDR1 mRNA随着药物浓度的增加而递增，说明药物诱导在MDR的产生中起重要作用；②通过转录激活使MDR1 mRNA表达增高，P-gp的药泵功能增强，从而增加细胞耐药性，说明癌基因通过MDR1和P-gp使细胞获得耐药性。Chin等实验表明，Ras基因对MDR1启动子有非特异促进效应，突变型p53有特异促进效应。癌基因mdm2作为p53基因的拮抗基因，可通过抑制P53基因产物的转录激活功能，而使之失去抑制肿瘤发生、发展的能力。已经发现在很少发生p53基因点突变的恶性肿瘤患者，常有较高比率的mdm2基因的高表达。mdm2基因可能与MDR1基因的活化有关[7]；③通过翻译或翻译后修饰来增加P-gp的水平，此时P-gp水平增高是由于P-gp的半衰期延长所致。P-gp的翻译后修饰是由于磷酸化作用位置的改变，磷酸化作用水平与P-gp表达数量是相关联的。参与P-gp磷酸化作用的酶包括蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)。磷酸化速度越快，P-gp向细胞外转运药物能力也越强，同时PKC活性增高，MDR1基因和P-gp过度表达。因此，PKC是通过诱导MDR1基因过度表达和加速P-gp的磷酸化而导致MDR的发生和发展的。
3 逆转P-糖蛋白的研究进展
3．1 单克隆抗体技术逆转MDR 用P-gp特异性抗体与P-糖蛋白结合，以抑制其活性及功能，或用单抗连接免疫毒素阻止抗药性，近来用P-gp抗体的胞内段的可变片段与载体结合后转染耐药细胞可以明显抑制P-gp的表达和功能，从而逆转多药耐药的发生[8]。
3．2 利用MDR1基因保护骨髓 若在强力化疗之前，将MDR1引入骨髓造血祖细胞，可以达到保护骨髓的作用。化疗药物的毒性作用主要是骨髓抑制，引入MDR1可以使患者接受相对大剂量的化疗，而且可以运用较多疗程的强力化疗，提高治疗效果。Hesdorffer[9]等将多药耐药基因逆转录病毒导入骨髓造血干细胞，使其对化疗产生耐药，化疗后再回输体内，这样可解除大剂量化疗对骨髓抑制的不良反应，为大剂量化疗提供骨髓保护。
3．3 反义技术逆转MDR 用人工合成或生物合成的特定互补DNA或RN段，转录后产生的反义核酸与靶mRNA结合，干扰MDR1DNA的转录或MDR1RNA的翻译，从而在翻译水平特异地抑制MDR1的表达[10]。
3．4 细胞因子的逆转作用 小剂量的a-INF，NTF-a，IL-2对耐药结肠癌细胞株有逆转作用。这些细胞因子可降低P-gp表达，降低其磷酸化程度，还可改变细胞膜的脂质组成和代谢影响P-gp的活动，增强化疗的敏感性。另外，这些细胞因子还具有促进凋亡的作用，可使受到化疗药物损伤的细胞来不及修复而进入凋亡，或是通过其他途径直接诱导凋亡而起到逆转耐药的作用。
3．5 核酶技术逆转MDR 核酶(ribozmye，Rz)是一类具有生物催化活性的RNA分子。它能够定点切割mRNA靶分子，从而有效阻断基因表达。导入能特异切割靶基因的锤头状核酶[11](hammerhead ribozyme)切割MDR1基因或c-fos基因而逆转耐药。Chen等[12]用MDR1核酶导入A549/R对MDR1 mRNA进行剪切，观察到MDR1的mRNA减少，P-gp表达下降，细胞对阿霉素的敏感性增加200倍。Kiehntopf等[13]选择靠近起始位点6到4的GUC三联码为Rz识别、切割的位点，通过体外转录法和化学合成法制备了针对MDR1 mRNA的Rz，应用脂质体将Rz基因导入肿瘤细胞，成功地逆转了肿瘤细胞的MDR，使肿瘤细胞对化疗药物的敏感性增加。
3．6 钙离子拮抗剂与免疫调节剂等MDR逆转剂的运用 试验证明钙离子拮抗剂(如维拉帕米VRP)可提高药物在耐药细胞内的积聚[14]。VRP能与P-gp结合，抑制P-gp对细胞毒药物的外排。另外VRP还能抑制P-gp的表达。免疫调节剂如环胞菌素A及其类似物(奎宁类，长春碱类和蒽环类)以及利血平等天然产物和多种合成化合物，都与P-gp具有亲和力，从而抑制其泵出功能，减少胞内药物排出。
4 P-糖蛋白/MDR1基因检测的意义及应用
4．1 预测患者对化疗药物敏感性，有针对性地选择最有效的化疗药物，避免盲目用药。
4．2 在化疗过程中，对MDR1基因表达进行动态监测，若发现进行性增高，提示获得性多药耐药的发生，应根据情况及时调整治疗方案。因实体瘤组织不能多次留取，因此临床现己开展采用外周血或腹水标木代替肿瘤组织来动态监测其MDR1基因表达以指导临床治疗[15]。
4．3 在进行化疗之前，如观察到P-gp/MDR1基因呈高表达，提示患者体内存在内在性多药耐药，可考虑使用逆转MDR的药物，增加化疗药物的敏感性。
4．4 治疗前或治疗过程中，对MDR1基因进行监测，可以预测肿瘤对治疗的反应、复发、转移等转归。
4．5 在肿瘤化疗中通过MDR1基因导入骨髓造血干细胞用于预防抗癌药物对骨髓造血功能的伤害。
4．6 MDR1基因治疗 ①MDR1载体可用于其他非选择性基因导入免疫系统的细胞或其他助于治疗肿瘤的细胞如CTL细胞；②将MDR1基因转染其他类型的细胞使它合成分泌一些物质而减轻肿瘤相关的并发症或减低肿瘤细胞局部浸润或转移的能力；③MDR1基因可用于修饰肿瘤细胞木身使其免疫原性增加或促其分泌细胞因子加强免疫反应；④由于造血细胞表达P-gp在体内具有选择优势，这将有助于造血系统疾病的体细胞基因治疗。
参 考 文 献
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