广西莪术多糖水提工艺优化及不同产地多糖含量测定

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇广西莪术多糖水提工艺优化及不同产地多糖含量测定范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

摘要：为了优化广西莪术多糖（Curcuma kwangsiensis polysaccharide，CKP）的水提工艺条件，以CKP含量为评价指标，采用正交试验考察料水质量比、提取温度、提取时间3个因素对CKP含量的影响并获得各条件的最佳组合。以6个产地CKP含量为考察指标，采用优化的水提工艺条件提取CKP，用H2O2水浴脱色，用Sevage法除蛋白质，用苯酚-硫酸比色法在490 nm波长下测定CKP含量。结果表明，最佳的水提工艺条件为料水质量比1∶5、在70 ℃下水提1.5 h，在此条件下，CKP平均含量为0.073 mg/g。6个不同产地CKP含量的差异较大，上思县思阳镇的CKP含量最高，为0.073 mg/g，横县南乡镇的CKP含量最低，为0.031 mg/g。正交试验优选的CKP水提工艺条件是科学可行的，广西境内不同产地的CKP含量存在差异，可为广西莪术的资源利用和质量控制提供理论依据。

关键词：广西莪术多糖（Curcuma kwangsiensis polysaccharide，CKP）；正交试验；水提工艺；不同产地

中图分类号：TQ461；R284.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）16-3947-04

广西莪术（Curcuma kwangsiensis S. G. Lee et C. F. Liang）是2010年版《中华人民共和国药典》收载的3种基原莪术中的一种，为姜科姜黄属植物的干燥根茎，为广西的地道药材[1]。莪术的主要有效部位为根和根茎，莪术的主要活性成分是挥发油和多糖[2]。莪术挥发油具有抗肿瘤、抗炎、抗凝血等作用，已广泛应用于临床。目前有关广西莪术的研究主要集中在莪术油的药效物质基础和临床应用开发上，有关广西莪术多糖（Curcuma kwangsiensis polysaccharide，CKP）的研究报道较少[3，4]，对CKP的提取工艺及不同产地的CKP含量的研究目前尚未见文献报道。而大量的研究证实，CKP具有多方面的药理活性，包括降血脂、降血糖、抗肿瘤、增强免疫力、抗氧化和抑菌等作用[5，6]。因此本研究采用正交试验，以CKP含量为检测指标，对广西莪术中多糖水提工艺进行优化，筛选出CKP的最佳水提工艺，在此基础上对不同产地的CKP含量进行比较研究，为广西莪术的生药品质评价和开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 UV-2401PC 型紫外可见分光光度计购自日本岛津公司，FW177型中草药万能粉碎机购自天津市泰斯特仪器有限公司，SHJM-1型数显恒温搅拌电热套购自山东省鄄城现代实验仪器厂，Hei-VAP型旋转蒸发仪购自德国Heidolph公司，80-1型电动离心机购自江苏省金坛市城西晓阳电子仪器厂，电子天平购自赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

1.1.2 原料 于2011年11～12月，在广西境内全面野外调查的基础上，采集了有代表性的6个产地的广西莪术（玉林市樟木镇、宾阳县新宾镇、横县南乡镇、上思县思阳镇、灵山县陆屋镇、玉林市成均镇）作为CKP的试验材料。所有样品经桂林医学院生药学教研室曾建红教授鉴定为姜科姜黄属植物广西莪术（Curcuma kwangsiensis S. G. Lee et C. F. Liang）的根茎。采收后将根茎除去杂质、去皮、洗净，晾干备用。

1.2 方法

1.2.1 水提工艺正交试验 根据浸提理论与实践经验，CKP的水提工艺与料水质量比、提取温度和提取时间等因素密切相关[7]。为选择最佳的水提工艺条件，本试验采用L9（34）正交试验，以产于上思县思阳镇的样品为试验材料，以CKP提取率为考察指标，因素与水平见表1。

1.2.2 CKP含量的测定

1）供试品溶液的制备。称取广西莪术鲜品100 g，切成片状，置于1 000 mL圆底烧瓶中，按料水质量比1∶5加入去离子水，在70 ℃浸提1.5 h，过滤，重复浸提3次，合并滤液，于60 ℃真空浓缩至150 mL。将30 mL 30% H2O2加入浓缩液中，水浴脱色2.5 h，液体颜色变为淡黄色后迅速加热，除去H2O2，加入去离子水将溶液定容至100 mL。采用Sevage法除去蛋白质[8]后，采用倾析法取上清液少许，加入1 mL 2 g/L茚三酮溶液，加热煮沸1 min，若无紫色出现，说明大部分蛋白质已经被除去。然后采用倾析法取上清液，加去离子水定容至100 mL，摇匀，即得供试品溶液。

2）标准品溶液的制备。精密称取于105 ℃干燥至恒重的葡萄糖标准品10.0 mg，置于100 mL容量瓶中，用去离子水溶解并稀释至刻度，摇匀，制得浓度为0.10 mg/mL的标准品溶液。

3）最大吸收波长的选择。取上述标准品溶液和供试品溶液各1 mL，分别置于具塞刻度试管中，各加入50 g/L苯酚溶液1.0 mL，混匀，再迅速各加浓硫酸5.0 mL，充分摇匀，放入-4 ℃冰箱中冷却。另取1 mL的去离子水同上平行操作制得空白对照液。在300～700 nm范围内扫描，以期找到吸收峰最大的吸收波长。

4）标准曲线的绘制。精密吸取标准品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、1.0、2.0 mL置于10 mL容量瓶中，加去离子水稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取各溶液1 mL，置于具塞刻度试管中，加入50 g/L苯酚溶液1 mL，混匀，迅速加浓硫酸5 mL，充分摇匀，放入-4 ℃冰箱冷却。另取1 mL的去离子水同上平行操作制得空白对照液。在490 nm波长处测量其吸光度，以浓度（x）对吸光度（y）进行线性回归，制得标准曲线。按所得标准曲线计算样品CKP含量。

1.2.3 稳定性试验 精密吸取供试品溶液1.0 mL，在0、2、4、6、12、24 h内，于490 nm波长处测定吸光度。

1.2.4 精密度试验 分别精密吸取标准品溶液6份，每份1.0 mL，在490 nm波长处测定吸光度。

1.2.5 重复性试验 取同一批号的广西莪术鲜品6份，每份约100 g，切成片状，平行制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液1.0 mL，在490 nm波长处测定吸光度。

1.2.6 加样回收率试验 分别称取已知CKP含量的广西莪术鲜品6份，每份约50 g，分别加入一定量的标准品溶液，制备供试品溶液。精密吸取供试品溶液1.0 mL，在490 nm波长处测定吸光度，计算回收率，回收率=（测得量-样品质量）/标准品加入量×100%。

1.2.7 不同产地CKP含量的测定 取6个产地的广西莪术鲜品，每个产地分别取3份，每份约100 g，切成片状，样品按最佳工艺条件提取，制备供试品溶液。精密量取供试品溶液1.0 mL，在490 nm波长处测定吸光度，按回归方程计算CKP含量。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长的选择结果

在300～700 nm范围内扫描发现，标准品溶液、供试品溶液均在490 nm处有最大吸收峰，故选择490 nm为测定波长。

2.2 标准曲线的绘制

标准品的标准曲线见图1。标准曲线的回归方程为：y=0.012 6x+0.229 0，r=0.999 1（n=6），葡萄糖在0.143～2.857 μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.3 稳定性试验、精密度试验、重复性试验和加样回收率试验结果

稳定性试验中吸光度的相对标准偏差为2.16%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。精密度试验中吸光度的相对标准偏差为0.68%（n=6），表明仪器精密度良好。重复性试验中吸光度的相对标准偏差为1.73%（n=6），表明本试验方法重复性良好。加样回收率试验的平均回收率为101.9%，相对标准偏差为3.11%（n=6），表明该方法的回收率较好，结果见表2。

2.4 水提工艺优化结果

2.4.1 正交试验结果 由方差分析结果可知，料水质量比、提取时间、提取温度3个因素3个水平对CKP含量均有显著性影响（P提取时间>提取温度，水提多糖的最佳工艺条件为A1B2C1，即料水质量比1∶5，提取温度70 ℃，每次提取1.5 h。

2.4.2 最佳工艺条件的验证结果 以产于上思县思阳镇的样品为试验材料，按优选的水提工艺条件进行了3次验证试验，即按料水质量比1∶5加去离子水，在70 ℃加热回流提取1.5 h。3次验证试验的CKP含量分别为0.071、0.075、0.074 mg/g，CKP平均含量为0.073 mg/g，相对标准偏差为3.27%。说明优选的水提工艺条件稳定、合理、可行。

2.5 不同产地CKP含量的测定结果

由表4可知，CKP含量从高到低的产地依次为上思县思阳镇、灵山县陆屋镇、玉林市樟木镇、玉林市成均镇、宾阳县新宾镇、横县南乡镇。6个不同产地的CKP含量存在差异。

3 小结与讨论

目前，对于广西莪术的研究和利用主要集中在莪术油的基础研究和临床研究上，而对于含量较高的莪术多糖的研究较少，因此，开展广西莪术多糖的研究具有较广阔的前景。影响中药浸提的因素很多，包括粉碎度、提取温度、提取时间、浓度、pH、溶剂量、压力等[9]。植物多糖提取率受提取时样品的状况和提取条件等的影响。提取植物多糖时，当提取液达到一定温度时，多糖会从药材浸出，但仍有一部分多糖在细胞内难以浸出，选择适宜的料水质量比可以促使多糖浸出，浸出后的多糖一部分扩散，一部分可能仍然吸附在药材表面，因而选择适宜的提取时间和提取温度，可以使多糖扩散达到平衡[10]。正交试验设计是一种高效、快速、经济的试验设计方法，是通过多因素多水平来优化的试验设计方案。本研究对料水质量比、提取温度、提取时间3个因素在3个水平上考察了它们对CKP含量的影响，设计了三因素三水平的正交表进行试验，大大节省了时间和材料，且结果有代表性，易进行统计学分析。

产地环境和植物本身的遗传特性是影响多糖含量的主要因素，采样季节和多糖提取工艺也会影响多糖含量的测定结果[11]。本试验对广西6个不同产地的CKP含量进行研究，结果表明，上思县思阳镇的CKP含量最高，平均含量高达0.073 mg/g，横县南乡镇的CKP含量最低，平均含量为0.031 mg/g，表明广西境内不同产地的CKP含量差异较大，产地对CKP含量的影响较大。由于上思县思阳镇的CKP含量远高于其他产地，在广西莪术的规模化生产中，建议选用上思县思阳镇的广西莪术作为优良种质，以保证和提高广西莪术的药材质量。同时还要注意到，这种相近产区不同产地主要活性成分的无地理规律的变异模式[12]，是由于每个产区取样过少产生的还是确实反映了CKP含量变异的本质，需要从遗传学、栽培历史和生态学等方面进一步探讨。

总之，本研究以CKP含量为考察指标，通过正交试验优选出了影响多糖提取率的主次关系依次是料水质量比>提取时间>提取温度。根据正交试验得出最佳工艺条件为料水质量比1∶5、在70 ℃下水提1.5 h，在此工艺条件进行提取可使CKP含量达到0.073 mg/g。正交试验优选的水提工艺条件的验证结果表明，所测得的CKP含量稳定，工艺方法合理可行，为下一步的研究和开发利用提供了依据。不同产地的CKP含量的比较结果表明，不同产地的CKP含量的差异较大，为广西莪术药材产地的选择及质量控制方法提供了一定的依据。

参考文献：

[1] 覃 葆，谢金鲜，杨海玲，等.不同炮制方法对广西莪术姜黄素成分及镇痛抗炎的影响[J]. 中国实验方剂学杂志，2011，17（10）：35-37.

[2] ZENG J H，XU G B，CHEN X. Application of the chromatographic fingerprint for quality control of essential oil from Guangxi Curcuma kwangsiensis[J]. Med Chem Res，2009，18（2）：158-165.

[3] 王关林，罗红梅，方宏筠，等. 莪术多糖的分离提取及其生物学活性研究[J].营养学报，2004，26（5）：366-369.

[4] 王关林，宋 扬，罗红梅. 莪术多糖对雏鸡抗氧化能力和免疫功能的影响[J].畜牧兽医学报，2006，37（11）：1184-1188.

[5] 张国强，杨正平.百合多糖提取及成分分析[J].湖北农业科学，2012，51（15）：3289-3299.

[6] 乔茜茜，祁 英，孙建忠，等.啤酒花多糖的提取及脱蛋白工艺研究[J].食品工业科技，2012，33（16）：251-253.

[7] 张黎明，朱 丽，李 雪，等.玉屏风总多糖水提醇沉工艺条件优化[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（1）：24-26.

[8] 丛景香，唐晓丹，张 伟，等. 正交设计优选水溶性黄蘑多糖提取工艺[J].时珍国医国药，2011，22（1）：91-93.

[9] 吴 颖，吴 健.白芍多糖水提工艺优化的初步研究[J].北方药学，2012，9（2）：19-20.

[10] 张黎明，朱 丽，李 雪，等.玉屏风总多糖水提醇沉工艺条件优化[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（1）：24-25.

[11] 白 音，王文全，包英华，等.不同产地美花石斛形态及多糖含量比较研究[J].中药材，2007，30（2）：130-132.

[12] 林家逊，曾建红，宋 波，等.半夏不同居群间生物碱含量的比较研究[J].时珍国医国药，2011，22（9）：2132-2133.