植物异黄酮合酶及其基因的研究进展
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摘要：异黄酮合酶（IFS）具有催化黄烷酮的活性，同时也是异黄酮生物合成代谢途径中的关键酶。详细阐述了植物异黄酮合酶及其基因的研究进展。
关键词：异黄酮合酶（IFS）；异黄酮合酶基因；植物
中图分类号：Q946 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）02-0258-04
异黄酮是由类黄酮生物合成代谢途径的中间产物黄烷酮在特定酶的作用下合成的，而催化黄烷酮进入异黄酮合成代谢途径的第一个反应的酶就是异黄酮合酶（Isoflavone synthase，IFS），同时也是异黄酮生物合成代谢途径的关键酶[1]。
1 异黄酮合酶的研究进展
20世纪60年代，科学家应用放射性标记前体技术已经发现异黄酮的生物合成的实质是黄烷酮B环移位重排现象造成的。此反应具有一定的立体专一性，一般只有（2S）-黄烷酮才可生成异黄酮，其直接的作用前体是甘草素（Liquiritigenin，7，4′―二羟基黄烷酮）和柚皮素（Naringein，5，7，4′―三羟基黄烷酮），产物是大豆苷元（Daidzein，7，4′―二羟基异黄酮）或染料木素（Genistein，5，7，4′―三羟基异黄酮）[2]。IFS催化此反应，但是在细胞中含量较低，且不稳定，1984年首次在大豆悬浮培养细胞微粒体中检测出IFS可催化黄烷酮B环从C2位移位到C3位且有反应活性的现象，而酶反应主要依赖O2和NADPH，但真菌激发子（Elicitor）处理样品后其活性可提升7～10倍[2]。之后，Kochs等[3]和Hashim等[4]的研究发现，在大豆和三裂葛悬浮细胞微粒体中黄烷酮生成异黄酮进行了两步反应。第一步反应是在NADPH和O2的参与下，IFS催化甘草素或柚皮素的B环移位生成2-羟基异黄酮；第二步反应是由异黄酮2-脱水酶催化脱水或2-羟基异黄酮自发生成大豆苷元或染料木素[5]，研究发现第一步反应中酶的活性可完全被不同的细胞色素P450蛋白抑制剂而抑制，NADPH：P450还原酶的体外重组体系和P450可将甘草素转化为2-羟基异黄酮[6]，表明IFS是一种依赖于P450的单氧酶。现今，有两种关于IFS可催化黄烷酮B环移位重排反应机制的解说，一种是黄烷酮1，2重排机制[4]，认为反应首先是在C3位发生脱氢现象，之后发生1，2重排，B环才从C2位迁移到C3位，而C2位羟基化生成了2-羟基异黄酮；另一种是离子机制[7]，认为B环的移位重排现象是通过形成烯醇式环氧化物而进行的。由于此离子机制涉及黄烷酮4′-羟基的去质子化和烯醇式环氧化物过渡分子4′-羟基的重新质子化两个反应，其疑问较大，因为更多的人倾向于第一种解说，但是反应的立体专一性有待进一步阐明。
近几年，IFS基因已被克隆，并在酵母中成功表达，从而实现了IFS酶蛋白简单纯化，为进一步深入分析IFS所参与的反应及其作用机理奠定基础[8]。Kim等[9]在酵母中表达了白三叶草IFS，并催化不同，研究表明酶活性是依赖C2和C3的饱和键，而C3不被羟基化和C7-OH存在是进行酶反应的两个必需的条件。通过已知的P450蛋白X衍射结构信息分析发现，组成P450蛋白活性中心是高度保守α-螺旋和β-折叠的结构，借助计算机生物信息学方法模拟结构，Sawada等[8]对在酵母中表达的甘草IFS进行了定点突变研究，结果表明酶蛋白活性中心的α-螺旋上的Ser310和β-折叠上的Lys375是酶活性所必需的结构， 黄烷酮C7-OH和Lys的ε-NH4+反应锚定了底物，确保了黄烷酮生成异黄酮过程中B环的迁移，如果Lys突变为Thr，则失去活性，而Ser为B环从C2到C3的迁移提供了空间保证，测定出IFS反应的最适pH为7～8，Km约为8 μmol/L。
2 异黄酮合酶基因的研究进展
2.1 IFS基因序列的研究
1997年，Akashi等[10]利用P450的保守序列的特性，首先采用PCR方法从甘草的培养细胞中克隆出8个P450的cDN段（Ge-1到Ge-8）。之后对Ge-5全长cDNA的阳性克隆的研究表明，Ge-5可编码（2S）-黄烷酮-2-羟基化酶（F2H）[11]。由于研究发现F2H和IFS是作用同一黄烷酮底物且进行不同分支代谢合成途径的2个酶，同时也发现了细胞微粒体膜上同时具有F2H和IFS活性，Akashi等[12]推测F2H和IFS可属于同一P450家族。因为甘草Ge-5和Ge-8同属于CYP93家族，所以用Ge-8作为探针从已诱导了6～12 h的甘草细胞cDNA文库中克隆出了Ge-8全长cDNA （CYP93C2，AB023636），并在酵母中成功表达，试验证明了CYP93C2编码蛋白可催化柚皮素或甘草素生成染料木素或大豆苷元，同时发现CYP93C2蛋白是IFS，同时Northern印迹法表明了在甘草培养细胞中经YE诱导6 h后IFS基因表达水平达到最高峰，并检测到异黄酮的含量也随之开始增加直至12 h达到最高峰。利用PCR技术，Kim等[9]克隆到白三叶草IFS全长cDNA（AY253284）， Shimada等[13]克隆到百脉根的IFS全长cDNA（LjCYP-1，AB024931）。
与此同时，Staele等[14]利用功能基因组学的研究方法，根据P450的保守序列特性，在真菌诱导下的大豆下胚轴EST文库中筛选出1条序列，研究发现该序列属于CYP93家族的序列，并克隆出全长cDNA（CYP93ClvZ，AF135484），序列分析发现CYP93ClvZ与大豆CYP93CI基本相同，在ORF中仅有3个氨基酸序列差异。将CYP93ClvZ转入到昆虫细胞进行表达分析，分离出NADPH、甘草甜素与微粒体一起孵育，通过HPLC、GC-MS验证有2-羟基异黄酮生成，充分证实CYP93ClvZ编码的蛋白是IFS。20世纪末，美国杜邦公司利用EST筛选技术，从诱导的栽培大豆叶片cDNA文库中克隆出了IFS全长cDNA（AF195798），并以此cDNA序列设计引物，通过RT-PCR技术分别从紫花首蓓（Medicago sativa，AFl95800，AF195801，AF195802）、毛苔子（Vicia villosa，AF195803）、小扁豆（Lens culinarys，AF195804，AF195805）、绿豆（Vigna radiata ，AF195806，AF195807，AF195808，AF195809）、红三叶草（Trifolium patense，AF195810，AF195811）、雪豆（Pisum sativm，AF195812）、羽扇豆（Lupinus albus，AF195813）、白三叶草（Trifolium repens，AF195814，AF195815）等9种植物中克隆出IFS全长cDNA[15]。2005年Cooper等[16]从昆虫诱导子处理后的雪豆的豆荚中克隆出了IFS基因（CYP93C18），Kim等[17]比较分析了18个不同类型的大豆栽培品种的IFS基因结构。同年，罗建平等[18]也从高含量合成异黄酮的豆科植物怀槐（Maackiaamurensis）中克隆出IFS的cDN段，长度800 bp，又进行了全长cDNA的克隆。
目前，根据已经克隆出的15种豆科植物中IFS的cDNA序列和功能分析（httpl//www.ncbi.dm.nih.gov），IFS基因的拷贝数为1～3个[13，15]，编码区中含有135～218 bp的内含子[15，19]，不同植物中的该基因全长cDNA序列高度保守，在400～600 bp和800～
1 200 bp两个区段完全相同，而由cDNA推测的蛋白氨分子质量约为59 ku，pI约为8.95，氨基酸序列的同源性在92%～97%之间[15]。研究发现，所有异源表达的IFS都具有催化合成异黄酮的功能，但来源不同的IFS催化柚皮素或甘草素生成染料木素或大豆苷元的能力有所差异。2004年，Subramanian等[19]分析了栽培大豆IFS基因的启动子结构，发现在
-125 bp和-264 bp处存在TATABox和CAATBox，而抑制子和增强子分别是在-537 bp和-887bp处，同时具有决定该基因在种子异表达的激发子响应序列EIRE（-565 bp）和SEF4结合域（-665 bp），在非豆科的双子叶和单子叶植物中IFS基因启动子可启动GUS等基因的正常表达，具有组织专一性，并受茉莉酸甲酯、水杨酸、UV、固氮菌等因素的诱导。
2.2 IFS基因表达调控的研究
IFS基因结构的研究及其克隆为利用分子生物学手段修饰豆科植物异黄酮合成代谢途径和使非豆科植物能够合成适量的异黄酮奠定了研究的理论基础。2000年，美国杜邦公司首次把栽培大豆的IFS基因转入到自身不能合成异黄酮的模式植物拟南芥中，并在转基因阳性植株的茎和叶片中检测到IFS基因表达的mRNA，而染料木素含量可达2 μg/g[15]。因为在所有的植物中都有合成异黄酮所需的底物柚皮素和甘草素，同时它们是类苯丙烷合成代谢途径的中间产物，所以转基因植株中的异源IFS同样利用这些物质作为底物合成异黄酮。
由于转基因植株中合成的异黄酮含量较低，进一步深入研究分析用转栽培大豆IFS基因的烟草、拟南芥和玉米细胞系对影响合成异黄酮含量高低的因子。在转基因烟草中，通过Northern、Western印迹和微粒体酶活性体外试验检测，结果都表明在叶片和花中都有IFS基因的表达产物，但只有在花中可检测出染料木素的积累，而叶片中无异黄酮的合成[20]。研究发现烟草花中花青苷（Anthocyanins）的含量是叶片的130多倍，表明不是异源表达的IFS活性自身限制了染料木素的合成，而是底物的获得应该是转基因植株能否促使异黄酮合成的制约因素，这是因为烟草花中花青素合成代谢途径中组织特异性的激活，可使已表达的IFS竞争代谢中间物柚皮素从而合成染料木素成为一种可能。在转基因拟南芥中，研究发现UV可增强类苯丙烷途径中合成花青苷且同时合成异黄酮的能力，同样证明了上述结论的正确性[20]。在转基因玉米的悬浮细胞中，也发现并证实转基因植物中IFS可依赖增强以提供中间代谢物或类苯丙烷途径的激活从而有效合成异黄酮。
由于玉米细胞中缺乏转录因子R（myc-type） 和C1（myb-type）而不能合成花青苷，当在C1的DNA激活区和结合区之间插入R构成融合转录因子CRC后，再将其转入到不能合成异黄酮的转IFS基因玉米细胞中，该转基因细胞不仅可合成花青苷，而且还可合成异黄酮[16，20]。而提高转基因植株合成较高含量异黄酮的另一个策略是切断与IFS竞争共同底物的分支途径。二羟基黄酮醇还原酶（DFR） 和黄烷酮-3-羟化酶（F3H）是与IFS竞争相同底物柚皮素分别合成黄烷醇和花青苷的分支酶。Liu等[21]将栽培大豆的IFS基因转入到拟南芥DFR和F3H的双突变体tt3/tt6中，因为2个分支途径被阻断，所以转基因植株中染料木素含量可提高5～30倍。Yu等[22]对栽培大豆DFR的活性进行了抑制，同样也获得相似的促进效果。
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