优选肠痈Ⅱ号提取工艺

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摘要：以HPLC法分析肠痈Ⅱ号君药主成分含量，分光光度法分析总黄酮含量，结合总浸膏量为综合参考指标，通过对比回流提取法，微波提取法，超声波提取法，优选出提取肠痈Ⅱ号的最佳提取工艺。结果表明，超声波法提取肠痈Ⅱ号综合评分为6.12，回流法提取肠痈Ⅱ号综合评分为5.96，微波法提取肠痈Ⅱ号综合评分为5.93。超声波提取为肠痈Ⅱ号的最佳提取方案，该方法可为复方中药质量评价提供参考。

关键词：肠痈Ⅱ号；正交试验；HPLC

中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）22-5581-04

肠痈Ⅱ号由君药：败酱草、二花；臣药：地丁、丹皮、丹参；佐使药：制附片、薏米仁、皂刺、木香、穿山甲等10味药材构成，具消肿散瘀、排脓解毒之效，效果甚佳。但传统以水煎药法对药物的有效成分破坏较大及水煎液容易发霉变质且杂质较多，药材利用率低并给患者带来很多不便，针对此种现状，采用适合于工业化生产的现代提取技术，对肠痈Ⅱ号提取工艺进行了比较系统的研究，以期为相关复方中药的质量评价提供参考信息。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

肠痈Ⅱ号药材（延安大学附属医院药剂科中药房提供，黄剑林主任药师鉴定）。

乙醇、甲醇、乙酸乙酯和磷酸为分析纯试剂，购于国药试剂责任有限公司；乙腈为色谱纯试剂，购于Sigma公司；去离子水。

绿原酸、木犀草苷、丹参酮ⅡA、丹皮酚、芦丁购自中国药品生物制品检定所。

1.2 仪器

KQ-300B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；194A07型MARS5（CEM公司）；SY-1000E恒温超声提取机（北京弘祥隆生物技术开发有限公司）；TU-1810型紫外可见分光分度计（北京普析通用仪器有限公司）；回流提取装置（陕西西安仪器厂生产）；FZ102型微型植物试样粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；ME2353型电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；Agilent1200型液相色谱仪（美国安捷伦公司）；正交设计助手Ⅱ V3.1专业版软件。

1.3 方法

1.3.1 提取工艺流程及综合评分方法 工艺流程为：称量样品无水乙醇提取滤液蒸干HPLC及比色测定综合评分。综合得分=（君药主成分含量×60%+总黄酮含量×20%+浸膏量×20%/投样量）×100。

1.3.2 HPLC定量方法 以肠痈Ⅱ号君药中败酱草、二花中的主成分化合物绿原酸、木犀草苷、丹参酮ⅡA、丹皮酚[1]为标准品，通过面积归一法测定样品中的含量。

1.3.3 HPLC色谱条件[2] 色谱柱Eclipse XOB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈和水（含0.08%磷酸，V/V），以梯度洗脱：在0～80 min，乙腈流动相为5%～100%（V/V），流速0.8 mL/min，进样量10 μL，检测波长274 nm，柱温25 ℃。该色谱条件下绿原酸、木犀草苷、丹参酮ⅡA、丹皮酚4种标品及样品成分均被分离洗脱结果见表1。

1.3.4 标准溶液和样品溶液的配制 分别精密称取适量绿原酸、木犀草苷、丹参酮ⅡA和丹皮酚用甲醇定容至10 mL，配成浓度分别为0.97、4.54、1.12和0.95 mg/mL的标准品溶液；精密称取100 mg样品置于100 mL容量瓶中，加入甲醇充分溶解后定容，摇匀，取少量过0.45 μm滤膜，弃去初滤液，收集续滤液为供试品溶液。

1.3.5 流动相洗脱程序 流动相梯度洗脱程序见表2。

1.3.6 总黄酮的测定[3] 准确称取芦丁5 mg，置于25 mL容量瓶中，用95%（V/V，下同）乙醇定容，用吸量管分别吸取其0～2.5 mL于25 mL容量瓶中，然后加入0.7 mL的5%（m/V，下同）NaNO2溶液，摇匀，放置5 min；加7 mL 10%Al（NO3）3（m/V）溶液摇匀，放置10 min；加 5 mL的1 mol/L NaOH摇匀，放置5 min，用95%乙醇定容至刻度。测定400～570 nm的吸光度。

准确称取样品14.0 g，按设计方法提取，合并滤液，减压浓缩至10 mL，以95%乙醇定容至25 mL。用吸管吸取3份0.5 mL样品，分别置于25 mL容量瓶内，测定步骤同上。计算公式：总黄酮含量//%=（比色浓度×1 mL×稀释倍数/投样质量）×100%。

1.3.7 回流法的正交试验设计 根据预试验结果，在相同条件下，选取提取温度、时间、液料比3项为考察因素，按表3的因素水平试验。

1.3.8 微波法的正交试验设计[4-8] 根据预试验结果，在相同的投样量（14.9 g）、粒度60目、提取次数3次（合并每次提取液）的一定条件下，选取输出功率、时间、提取温度、液料比4个因素进行试验，按表4的因素水平表安排试验。

1.3.9 超声波法的正交试验设计 根据预试验结果，在相同的投样量（14.9 g）、粒度80目、提取次数3次（合并每次提取液）的一定条件下，根据单因素试验结果，选取输出功率、提取时间、提取温度、液料比4个因素进行试验，按表5的因素水平表安排试验。

2 结果与分析

2.1 方法学分析

2.1.1 稳定性分析 将同一样品按供试品溶液的制备方法制备后，每隔5 h测定1次，n=3，可知绿原酸、木犀草苷、丹参酮IIA和丹皮酚的RSD分别为2.1%、1.8%、1.2%和2.8%。说明绿原酸、木犀草苷、丹参酮ⅡA和丹皮酚在20 h内稳定。

2.1.2 重复性分析 将同一样品用上述供试品溶液的制备方法制备5份，n=3，进行HPLC分析。绿原酸、木犀草苷、丹参酮ⅡA和丹皮酚的RSD分别为1.1%，2.3%，2.5%和1.9%，表明该方法重复性良好。

2.1.3 精密度分析 将同一标准品溶液，按上述色谱条件连续进样5次，n=3，以峰面积计算绿原酸、木犀草苷、丹参酮ⅡA和丹皮酚的RSD分别为2.1%，1.7%，2.3%和1.5%，表明该方法精密度良好。

2.1.4 HPLC的线性关系考察 精密吸取一定量标准品溶液，作HPLC分析，以峰面积对进样浓度求得回归方程，相关系数及线性范围，其中绿原酸的线性回归方程为y=900 000 000 x+790 790，R2=1.000 0，线性范围为0～1 mg/mL；木犀草苷为y = 60 000 000 x-100 000，R2=0.999 7，线性范围为0～4 mg/mL；丹参酮ⅡA为y= 200 000 000 x-600 000，R2=0.997 7，线性范围为0～1 mg/mL；丹皮酚为y = 100 000 000 x + 374 218，R2=0.999 8，线性范围为0～1 mg/mL。

2.1.5 回收率分析 取已知含量的样品适量，加入一定量的绿原酸、木犀草苷、丹参酮ⅡA和丹皮酚标准品溶液，按样品制备方法制备，n=3，进行HPLC分析，测得绿原酸、木犀草苷、丹参酮ⅡA和丹皮酚的回收率分别为98.7%（RSD=2.1%）、100.5%（RSD=2.7%）、99.4%（RSD=1.5%）和102.9%（RSD=3.1%）。

2.2 总黄酮工作曲线的绘制[3]

扫描芦丁样品溶液400～570 nm所对应的吸收波长，确定最大吸收波长为508 nm；固定吸收波长为508 nm，以2号为参比溶液分别测定不同标准溶液的吸光度，计算线性回归方程为y=0.012 4 x-0.006 2，R2=0.999 7

2.3 正交分析结果

2.3.1 回流提取法的正交试验结果 直观分析与方差分析结果见表6、7。由表6可知，影响无水乙醇回流提取肠痈Ⅱ号的主次顺序为A>B>C。以空白项为误差项做方差分析，结果见表7，由表7可知，A因素对结果有显著性影响。其最佳工艺为A2B2C2，即提取温度60 ℃，每次提取时间2 h，液料比20∶1。

2.3.2 微波提取法的正交试验结果 直观分析与方差分析结果见表8。由表8可知，影响微波法提取肠痈Ⅱ号的主次顺序为A>B>D>C。以极差最小项C为误差项做方差分析，结果见表9。由表9可知，A因素对本试验有显著性影响。综合考虑最佳工艺为A2B3C2D1，即输出功率960 W，提取时间30 min，提取温度60 ℃，液料比15∶1。

2.3.3 超声波提取法的正交试验结果 直观分析与方差分析结果见表10。由表10可知，影响超声波法提取肠痈Ⅱ号的主次顺序为A>C>B>D。以极差最小项D为误差项做方差分析，由表11方差分析可见A、C因素对结果有显著性影响。其最佳工艺为A2B2C2D2，即输出功率800 W，提取时间70 min，提取温度50℃，液料比25∶1。

2.4 正交试验分析

2.4.1 回流提取法的工艺验证 在相同的投样量（14.9 g）、粒度60目、提取次数3次（合并每次提取液），A2B2C2即提取温度60 ℃，每次提取时间2 h，液料比20∶1。平行3次试验验证此工艺，综合平均得分为5.96，高于预试验、单因素及正交试验中任何一组结果，结果表明该工艺稳定可行。

2.4.2 微波提取法的工艺验证 在相同的投样量（14.9 g）、粒度80目、提取次数3次（合并每次提取液），A2B3C2D1，即输出功率960 W，提取时间30 min，提取温度60 ℃，液料比15∶1。平行3次试验验证此工艺，综合平均得分为5.93，高于预试验、单因素及正交试验中任何一组结果，结果表明该工艺稳定可行。

2.4.3 超声波提取法的工艺验证 在相同的投样量（14.9 g）、粒度80目、提取次数3次（合并每次提取液），A2B2C2D2，即输出功率800 W，提取时间70 min，提取温度50 ℃，液料比25∶1。平行3次试验验证此工艺，综合平均得分为6.12，高于预试验、单因素及正交试验中任何一组结果，结果表明该工艺稳定可行。

3 小结与讨论

上述结果表明，超声波法综合评分为6.12>回流法综合评分为5.96>微波法综合评分为5.93。超声波法提取效率高、操作简便、省时；微波法虽然操作简便、省时，但相对提取率不高；回流提取法操作过程繁琐、提取率不高、耗时。

另外，中草药处理一直延续传统的水煎法，但由于水煎法温度高，会破坏有效成分，而且还存在较多杂质。本试验通过肠痈Ⅱ号的工艺研究，以HPLC法检测君药中主成分含量，分光光度法检测总黄酮含量，并结合总浸膏量为依据，系统分析了各因素对提取过程产生的影响，为后期复方中药质量评价提供参考。

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