基于大肠杆菌的全细胞微生物传感器的构建及其在急性生物毒性检测中的应用
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摘要：构建了以大肠杆菌为指示生物的全细胞微生物传感器，初步探讨了其在重金属（Cu2+， Zn2+， Pb2+）及其二元联合毒物、农药污染物（莠灭净、乙酰甲胺磷）的急性生物毒性分析中的应用性能。结果表明，基于对数生长后期和稳定期的大肠杆菌微生物传感器具有良好的毒性分析性能。最优实验条件为： E.coli培养16 h，苯醌为电子传递介体，呼吸基质pH 6～8。所测毒物对E.coli的呼吸抑制作用大小顺序为： Cu2+> Zn2+> Pb2+，乙酰甲胺磷>莠灭净，与发光细菌、鱼类、藻类等其它方法检测所得结果一致。这种电化学全细胞生物传感器毒性分析方法具有快速灵敏、成本低廉、操作简单等优点，有望用于水体急性生物毒性的在线监测。
1引言
随着工农业生产的迅速发展，越来越多的有毒物质（如重金属和农药）进入水体，对水环境造成严重污染[1]。这些物质在环境中经过复杂的物理、化学和生物转化过程，又会形成新的污染物，一些污染物还可能进入食物链并在生物体内蓄积，最终对生物产生各种各样的毒性效应[2]。急性生物毒性实验可以探明环境污染物与机体短时间接触后所引起的损害作用，为环境污染提供预警[3]。
传统的理化分析方法可以定量分析某一种或某一类污染物的含量，但不能直接全面地反映各种有毒物质对环境的综合影响，无法判定有毒物质浓度和生物效应之间的直接关系[4，5]。除此之外，还需要昂贵的仪器设备，操作程序复杂，并且不能用于水体生物毒性的在线监测。利用微生物传感器对水环境进行生物毒性检测的方法，不仅具有成本低、易操作、结果直观等优点，它还可以直接测定水体污染物的急性生物毒性，其测定值能较全面地反映水体中污染物的总毒性效应，具有实际参考价值[6，7]。目前研究和应用最多的是发光细菌（Luminous bacteria）传感器，通过光电装置检测在毒物作用下发光菌的光强度变化，评价待测物质的毒性，但这种方法易受样品色度、浊度和盐度干扰，检测前需要对样品进行预处理[8]。
本工作基于电子传递介质的全细胞微生物传感器毒性分析系统，以大肠杆菌为受试微生物，几种常见重金属（Cu2+， Zn2+， Pb2+）、农药（莠灭净、乙酰甲胺磷）的单一和混合形式为毒性物质模型，对实际水体的生物毒性进行了初步检测。其工作原理为：固定于传感器工作电极表面的微生物呼吸作用产生的电子通过电子传递介质在微生物细胞和电极表面之间传递，检测形成的生物电流信号。当毒性污染物存在时，微生物细胞呼吸作用因受到毒性抑制作用，从而表现为电流强度的变化。初步研究表明，这种全细胞微生物传感器毒性分析法具有不受样品色度和浊度干扰等特点，并可通过选择固定特定毒性敏感指示微生物对不同污染物的毒性做出评价，毒性分析结果更客观真实，检测范围宽、灵敏、快速、成本低，适用于大批量化合物和样品的初筛。此技术的开发有望用于污染水体的急性生物毒性在线监测和快速预警。
2实验部分
2.1仪器与试剂
而培养32 h时毒性分析灵敏性明显下降。由此可见，E.coli 处于对数生长期和稳定期时对金属离子具有良好的毒性敏感性，而处于衰减期时敏感性能下降。其次培养周期为16和24 h时， 制备的微生物传感器在加入氧化还原介质后， 稳态电流均在400 nA以上；而32 h时， 稳态电流约为100 nA，同时检测电流的响应曲线平滑度降低，出现数值波动。另外，培养周期为16 h时获得的E.coli菌体量较高。故实验选择E.coli培养周期为16 h。
生物传感器常需要借助电子传递介体加强微生物细胞（或酶）和电极之间的直接电子传递，以加快反应速度，降低环境干扰。常用的电子介体有K3Fe（CN）6、醌类等。本实验考察了K3Fe（CN）6和p苯醌对传感器电流信号响应的影响。由图3B可见，以亲脂性的p苯醌为电子传递介质时，电流信号响应良好，加入苯醌（0.4 mmolL） 10 s后，电流信号迅速上升，15 min时达到稳定状态，能很好地满足后续生物毒性测定的要求。以0.4～4.0 mmolL K3Fe（CN）6 为电子传递介质时，传感器的电流响应未能有效增强，检测到的电流增幅均小于苯醌的电流响应。这可能是因为K3Fe（CN）6具有非亲脂性，使其难以穿透细胞膜进入细胞质内的氧化还原位点，与文献[11]的结果一致。Pablo等[12]发现，K3Fe（CN）6在生物学实验中可能发生分解，这意味着K3Fe（CN）6可能对生物催化反应过程造成意想不到的影响，如破坏电子转移，甚至导致微生物机体的死亡[13]。本实验选用p苯醌作为电子传递介质。
为考察pH值的影响，在加入电子传递介质信号稳定后，用0.1 molL 的HCl和NaOH调节呼吸基质pH值。如图3C所示，pH
3.3对单一及混合重金属、农药的急性生物毒性的测定
乙酰甲胺磷是一种低毒型有机磷杀虫剂；莠灭净为嗪类除草剂，具有良好的水溶性，可能渗入到地下水中。通过计时电流法分别测定了它们在单一和混合时的急性生物毒性效应。图3D是纯乙酰甲胺磷原药和纯莠灭净原药分别在最终浓度为100、50 和25 mgL对大肠杆菌呼吸活动的抑制率。结果表明，乙酰甲胺磷原药对大肠杆菌的毒性效应比莠灭净原药强。同时还检测了乙酰甲胺磷40%剂型商用农药，发现其对大肠杆菌的毒性效应比纯乙酰甲胺磷原药强，这可能是因为乙酰甲胺磷商用农药里含有苯的缘故。纯乙酰甲胺磷和纯莠灭净按1∶1配成混合农药，检测其对大肠杆菌的联合毒性。结果表明，其联合毒性比单一组分的生物毒性强很多，可能是由于混合组分发生了相互作用，影响了其在生物体内的分布、吸收，生物转化、生物利用等[19]，但这种相互作用的具体机制目前仍不清楚。
3.4微生物电极的重复性和稳定性
同批次制备的E.coli微生物电极平行测定40 mgL Cu2+ 溶液3次，相对标准偏差为2.3%；将此电极置于4 ℃的冰箱中考察其稳定性，每隔7 d测定一次，21 d后仍保留响应电流的70%左右，表明此电极具有较好的重复性和稳定性。
3.5对实际水体急性生物毒性的检测
采用自制的E.coli型微生物传感器对有机实验室废水和河水样品进行了综合毒性测定。100 待测样品加入到10 mL呼吸基质中，测得有机实验室废水和河水样品对E.coli呼吸活性的抑制率分别为95.14%和0.62%，故实验室废水的综合毒性很大，河水样品可视为没有毒性。
4结论
本研究制备了大肠杆菌全细胞微生物传感器，并应用于常见重金属、农药和实际水体的急性生物毒性的测定，有良好响应。与传统生物学方法相比，本方法无需对样品预处理，操作更简单、快速。下一步实验将通过固定特定敏感菌株或混合菌种来提高微生物传感器检测的灵敏度或广谱性，以克服如发光菌等毒性分析方法中存在的菌株选择的局限性，使毒性反映结果更为真实。