植物胰岛素的分离纯化及降糖作用的实验动物研究
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摘 要：目的：探寻大量纯化苦瓜中植物胰岛素的技术方法。 方法：采用盐析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析三步技术纯化苦瓜中植物胰岛素，并行电泳、层析和动物实验鉴定，壳聚糖包封。 结果：目的提取物于11000处出现一条电泳带，相对迁移率与胰岛素相同；壳聚糖包封后苦瓜中植物胰岛素的降糖作用更显著。 结论：本方法可适用于大量纯化苦瓜中植物胰岛素。
中图分类号：R285 文献标识码：A 文章编号：1673-7717（2011）04-0825-03
Seperation and Purification of Plant Insulin and Its Hypoglycemic Effect on the Experimental Animals
JUN Xu【sup】1【/sup】，WU Peng【sup】1【/sup】，HAN Lin【sup】1【/sup】，ZHANG Zhong【sup】1【/sup】,HUANG Zhu-qing【sup】2【/sup】
（1.Science Laboratory Center Shenyang medical college, Shenyang 110034,Liaoning,China；
2.Liaoning Vocational College of Pharmacy, Department of Health, Shenyang 110101,Liaoning,China）
Abstract:Objective: To explore a technical method to purify the plant insulin in the bitter melon.Methods:applying three-step methods to purify insulin from bitter melon these are salting out, ion exchange chromatography and gel filtration chromatography. And than using electrophoresis chromatography, animal experiments and chitosan envelopment methods to identify it.Results:The extracts appeared electrophoresis band at the 11000 molecular weight, and had the same relative mobility with insulin. The plant insulin from the bitter melons has the hypoglycemic effect significantly after the chitosan envelopment methods. Conclusion:To stabilized extract the plant insulin from the bitter melon can depend on this method mentiond in this paper.
Key words:Plant insulinChitosanPurifay
现代医学证明苦瓜作为一种功能食品，具有降低血糖，抗病毒、抗肿瘤，增强机体免疫力等作用，被认为是新一代疗效高、副作用小的降血糖天然药物的典范【sup】［1］【/sup】。同时，更因为苦瓜含有一种降低血糖的多肽――植物胰岛素，使人们对从中研制胰岛素的口服替代品充满了希望。目前，业已可通过有机酸、醇、丙酮沉淀、薄层层析、盐析、阳离子交换层析等传统或改良的实验室分离方法【sup】［2-3］【/sup】，从苦瓜中获得纯度较高的植物胰岛素。然而，程序繁杂、实验技术要求高、应用样品量小，仍是这类方法难以实现大量纯化苦瓜中植物胰岛素的瓶颈。我们经过研究与改进，建立了通过盐析、阴离子交换层析、凝胶过滤等技术大量纯化苦瓜中植物胰岛素的程序化制备过程，并形成壳聚糖包封的口服制剂，进而为苦瓜中植物胰岛素广泛、有效的应用奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
新鲜苦瓜（市售）。A缓冲液：0.1M/L Tise-HCl pH7.0；B缓冲液：0.1M/L PB pH7.0（均为国药集团化学试剂沈阳有限公司提供）。
1.2 仪器
DEAE-Sepharose FF（美国GE公司）；Sephdex G75（美国GE公司）；FPLC（美国GE公司）；核酸蛋白计算器（美国GE公司）；四氧嘧啶糖尿病大鼠（北京军科院动物研究所）；冷冻高速离心机（日本HITACHI公司）；血糖测定仪（国产）。
1.3 方法
1.3.1 苦瓜中植物胰岛素的纯化 新鲜苦瓜500g去籽，－20℃冷冻8h以上，组织破碎仪粉碎，苦瓜粉末用100mL A缓冲液采用微波震荡15min溶解。溶解后12000r/min 4℃离心20min，收集上清。
取上清，测量体积，按最终浓度30%（0.176g/mL）加入硫酸氨，边加边搅拌，致完全溶解后，再4℃搅拌2h，静置1h。12000r/min 4℃离心20min，弃上清，沉淀用20mL A缓冲液溶解，5000透析袋对A缓冲液透析过夜，期间更换一次透析外液。透析后，收集透析内液12000r/min 4℃离心20min，收集上清。
透析后上清应用于DEAE-Sepharose FF柱，柱尺寸15cm×1.5cm，柱预先用150mL 缓冲液平衡。FPLC进行层析分离，上样后待基线稳定后，用A缓冲液（含0.5M NaCl）洗脱，馏分收集10mL/管，检测波长280nm，流速0.5m/min。馏分形成3个峰，10、11管（Ⅰ峰）；13、14管（Ⅱ峰）；16、17管（Ⅲ峰），SDS电泳检测，取Ⅱ峰样品浓缩至5mL，样品装入5000透析袋中对B缓冲液透析过夜，应用于Sephdexe G75凝胶柱，柱尺寸30cm×1.0cm，柱预先用200ml B缓冲液平衡，FPLC层析分离，流速1.0mL/min，馏分收集10mL/管，获得Ⅱa和Ⅱb 2个主峰。样品经冷冻干燥后密封4℃保存。
1.3.2 苦瓜中植物胰岛素的鉴定 分别收集凝胶过滤层析后2个主峰。采用纤维素薄膜层析方法进行层析分离，样品为Ⅱa主峰、Ⅱb主峰和胰岛素注射液，展开剂为正丁醇（V）：甲酸（V）3:2。SDS电泳，浓缩胶3%，分离胶10%，电流100mV，电泳2h。
1.3.3 苦瓜中植物胰岛素壳聚糖纳米粒的制备 采用文献方法【sup】［4］【/sup】制备纳米颗粒，其药物包封率为75%以上。
1.3.4 降糖动物实验 取四氧嘧啶糖尿病大鼠分4组，每组10只。1组、2组为实验组，分别口服植物胰岛素壳聚糖纳米颗粒，3.5g/kg含植物胰岛素2.63g），1天1次。3组为对照组，口服壳聚糖，3.5g/kg，1天1次。4组为口服降糖药组，0.1mg/kg，1天1次。口服5天后，尾静脉取血，测血糖值。
2 结 果
经DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析纯化的样品，馏分后形成3个蛋白峰（见图1）；经SDS电泳检测，仅峰Ⅱ于11000处出现一条带，峰Ⅰ和峰Ⅲ则未见（见图2）；峰Ⅱ进行凝胶过滤层析后，获得Ⅱa和Ⅱb 2个主峰（见图3）。薄层层析检测，Ⅱa主峰、Ⅱb主峰和胰岛素注射液的相对迁移率分别为0.20、0.24和0.24，可见胰岛素注射液和Ⅱb主峰的迁移率相同。SDS电泳结果（见图4）为Ⅱa主峰的相对分子量为45000，Ⅱb主峰为11000。
降糖动物实验结果为，口服植物胰岛素组和降糖药物组5天后血糖值明显低于对照组（P＜0.01），见表1。
表1 植物胰岛素壳聚糖纳米颗粒对糖尿病
小鼠血糖的影响（±s）
3 结 论
1981年，Khanna等【sup】［2］【/sup】从苦瓜果实中分离出一种多肽，并证实其具有降低血糖的作用，后被人们称之为植物胰岛素。大量研究显示，苦瓜中植物胰岛素可增强肌肉、肝脏对餐后血糖的贮存效率，减少肝内葡萄糖过量释放；可抑制葡萄糖的合成，加强葡萄糖的氧化利用；可促进胰腺β细胞更新及部分受损的β细胞修复，改善β细胞分泌胰岛素的能力【sup】［5-6］【/sup】。同时，与动物和化学合成类降糖产品相比，苦瓜中植物胰岛素具有基本无不良反应，降糖效果缓慢持久，长期服用不致过度降低血糖，停药后24h内血糖没有回升【sup】［7］【/sup】，以及无注射之苦等优点。
目前，有关苦瓜中植物胰岛素的分离和提取方法较多，但大多是以Khanna建立的有机酸、醇提取，薄层层析分离【sup】［2］【/sup】，Rp-高效液相法【sup】［8］【/sup】，结合阳离子交换层析方法【sup】［3］【/sup】作为基本框架和程序。虽然这些方法可获得95%以上纯度的苦瓜中植物胰岛素，且动物实验证实降糖效果确切，但此类方法却严重存在着因仪器设备的客观限制致使上样量较低，不适合大量制备进行规模化生产等问题，进而限制了植物胰岛素的广泛应用。
本研究采用盐析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析三步制备技术，从苦瓜中提取植物胰岛素。其中，盐析可去除了大部分杂质，包括一些脂蛋白和一些甾类有机化学物质；阴离子交换层析后，一些高等电点的蛋白可被分离，而集中收集分子量为11000的蛋白峰；再经凝胶过滤层析后，可将分子量大的蛋白排阻出去。结果显示，本方法馏分后所获的峰Ⅱ于11000处可出现一条电泳带，与文献报道的苦瓜中植物胰岛素的分子量相近【sup】［9］【/sup】；Ⅱb主峰的相对迁移率与胰岛素的相对迁移率均为0.24；提取物的纯度在95%（电泳纯）以上。这提示，本方法的提取物在化学性质上与胰岛素相似，具有较为理想的纯度。为了验证提取物的作用和壳聚糖的包封效果，我们进行了动物降糖实验。结果表明，本方法的提取物具有较好的降血糖作用，壳聚糖包封可明显地提高植物胰岛素的降糖作用。
总之，我们通过盐析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析三步制备技术所获得的苦瓜中植物胰岛素，在化学性质、纯度和降糖效果上均得到了良好的结果。更为重要的是，本方法实现了向大量纯化苦瓜中植物胰岛素的迈进，从而为苦瓜中植物胰岛素的广泛应用奠定了技术基础。
参考文献
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