槐定碱抗骨癌痛作用及其机制研究
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[摘要] 目的：采用W256癌细胞诱导的骨癌痛模型大鼠探讨槐定碱抗癌痛药效及其作用机制。方法：采用骨髓腔注射W256癌细胞复制骨癌痛大鼠模型；造模10 d后选取模型复制成功的大鼠36只随机分为模型对照组及槐定碱治疗组，另取同期10只大鼠作为正常对照组；治疗组大鼠于造模第15天开始给予槐定碱25 mg・kg-1治疗10 d；各组大鼠给药前、后测量机械痛阈和热痛阈，末次给药后， 对大鼠患肢进行放射学和组织病理学观察，并采用免疫组化法检测大鼠患肢肿瘤组织环氧酶-2（COX-2）、血管内皮生长因子（VEGF）的表达。结果：槐定碱可明显提高骨癌痛大鼠机械痛阈和热痛阈值（P
[关键词]槐定碱；W256癌细胞；骨癌痛；COX-2；VEGF
槐定碱是从豆科槐属植物苦豆子中提取分离的单体生物碱（C15H24N2O，相对分子质量248.36）。研究表明，槐定碱是一种高效低毒的抗癌生物碱，具有抗肿瘤、镇痛、抗炎等多种药理活性[1-3]。已开发的制剂“盐酸槐定碱注射液”目前在临床上仅试用于恶性滋养细胞肿瘤的治疗，尚有较多的适应症有待进一步开发。本研究旨在采用W256癌细胞诱导的骨癌痛模型代替传统的疼痛模型，对槐定碱的抗癌痛作用进行初步药效观察和部分机制探讨，为槐定碱的进一步开发和增加新的临床适应证提供理论和实验依据。
1材料
1.1药品与细胞株 槐定碱，纯度≥98%（南京景竹生物科技有限公司）；W256癌细胞，由浙江医学科学院提供腹水癌细胞种鼠，经本课题组纯化培养所得。
1.2试剂 乙二胺四乙酸二钠（天津市顶福化工总厂）；戊巴比妥钠（上海化学试剂公司）；25%戊二醛（上海化学试剂采购供应站五联化工厂）；二甲苯（上海化学试剂公司）；无菌骨蜡（安徽省第二人民医院提供）；COX-2免疫组化试剂盒（SP浓缩型，北京中山生物技术有限公司）；VEGF免疫组化试剂盒（武汉博士德生物技术有限公司）。
1.3动物 雌性SD大鼠，清洁级，体重180～200 g，购自浙江中医药大学实验动物中心，合格证号SYXK（浙）2012-0013。
1.4仪器 XZC-A型压力测痛仪（山东医学科学院）；XZC-2B型自控温度热板仪（山东省医学科学院）；石蜡切片机 M3500（深圳威斯比生物科技发展有限公司）；高频乳腺摄片机（意大利）； C3040-ADUS型光学显微镜照像系统（日本OLYMPUS公司）。
2方法
2.1骨癌痛模型复制与鉴定 按照文献所述方法制备W256癌细胞悬液和复制骨癌痛模型[4-5]：取雌性SD大鼠40只，左后肢去毛消毒、麻醉，手术切开胫骨中上端皮肤约0.5～1.0 cm，暴露胫骨，先用7号针头穿刺打孔，再用5 μL微量注射器向骨髓腔注入3 μL约含4×103个W256癌细胞的细胞悬液，骨蜡封住针孔，缝合切口。大鼠术后常规饲养10 d后，戊巴比妥钠麻醉，将患肢置高频乳腺摄片机下摄片观察，选取胫骨上端出现明显缺损灶的大鼠用作实验。
2.2分组与给药 选取模型复制成功的36只大鼠，随机分为模型对照组和槐定碱治疗组，每组18只；另取同期10只大鼠以生理盐水代替癌细胞悬液注入骨髓腔作为正常对照组。自术后第15天开始给药。其中，槐定碱治疗组腹腔注射槐定碱水溶液25 mg・kg-1（按体表面积计算，相当于临床推荐最大剂量），对照组和模型组腹腔注射等体积生理盐水，各组大鼠每天给药1次，共10 d。
2.3痛阈测量 各组大鼠分别于给药前和给药后，参照文献所述方法[5]，采用足趾压痛法和热板法分别测量机械痛阈及热痛阈的变化。机械痛阈测量：将大鼠患肢足掌置于压力测痛仪压力针下，启动电动按钮，以出现嘶叫或缩足为痛反应，此时所需压力值（×10 g）即为该动物的机械痛阈值。热痛阈测量：调节热板仪温度至（52±0.1） ℃，然后将大鼠置于热板上，以大鼠出现添后足时所需时间作为该动物的热痛阈值。上述痛阈测量每只大鼠均需测量2次，且间隔3 min以上，取2次均值作为该动物的痛阈值。
2.4放射学观察 各组大鼠于末次给药后，3%戊巴比妥钠麻醉，将患肢置高频乳腺摄片机下摄片，并参照文献所述方法进行骨损伤评分[5]。
2.5病理学观察（HE染色） 摄片后脱颈椎处死大鼠，剪下患肢，分离胫骨并修剪，取患骨0.3～0.5 cm，4%中性甲醛固定3 d，10%EDTA（pH 7.0～7.4）脱钙4周，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，常规切片，HE染色，光镜观察并摄片。
2.6免疫组化检测COX-2和VEGF蛋白表达（SP法） 上述石蜡切片按试剂盒说明书进行免疫组化染色，中性树胶封片、摄片并分析。结果判定：以积分吸光度（IA，IA=阳性面积×平均吸光度）表示COX-2和VEGF蛋白表达量，每张切片于10×40倍光镜下随机分析5个视野，取其均值代表该样本蛋白表达量。图像分析系统为Image-pro plus 6.0。
2.7统计分析 采用SPSS 11.5软件进行统计学分析。数据采用±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），2组间均数比较采用q检验，显著性差异标准为α=0.05。
3结果
3.1槐定碱对大鼠机械性痛阈的影响 各组动物在造模后第14天开始出现明显机械性痛觉超敏反应，机械刺激痛阈值显著下降（P
3.2槐定碱对大鼠热痛阈的影响 造模动物在术后第14天出现明显热痛觉超敏，热痛阈值显著下降（P
3.3放射学观察 对照组骨皮质完整，骨松质无缺损灶；模型组大鼠骨破坏严重，松质骨放射性缺损灶显著，同时骨皮质缺损严重， 病灶范围较大，个别大鼠出现病理性骨折；槐定碱治疗组骨皮质基本完整，但松质骨缺损灶仍较明显。放射学评分结果表明，与对照组比较，2组造模大鼠骨组织均出现显著的骨损伤（P
3.4组织病理学观察 对照组大鼠骨髓腔内骨小梁和骨皮质完好，并可到各种正常的骨髓细胞；模型组大鼠骨髓腔基本被肿瘤细胞填充，骨松质几乎全部被破坏，骨皮质受损广泛、局部变薄或缺损，髓腔中心可见退变坏死的肿瘤细胞，边缘部分的肿瘤细胞多呈活跃状态，并向外侵袭；槐定碱治疗组大鼠动物髓腔内肿瘤细胞数量相对模型组减少，且多数已退变坏死，边缘部分的肿瘤细胞大多欠活跃，骨松质及骨皮质受损情况较模型组有明显减轻，见图2。
3.5槐定碱对大鼠患骨组织COX-2和VEGF表达的影响 与对照组比较，模型大鼠骨组织COX-2和VEGF表达量显著增加（P
4讨论
癌症痛不同于一般的炎性痛和神经病理性疼痛，其发生发展有其独特的机制[6] 。因此，采用普通疼痛模型进行抗癌痛药物的相关评价存在明显的局限。Walker-256癌细胞来源于大鼠原发性乳腺癌组织，且具有良好的骨侵袭能力[7]。作者采用W256癌细胞注入大鼠骨髓腔成功制备了骨癌痛模型[8]，以该模型替代普通疼痛模型进行抗癌痛药物的相关研究，更加切合临床病症实际，提升了研究结果的实用性和科学性。
研究表明，乳腺癌组织中高表达环氧酶-2（COX-2）， COX-2的过度表达可以促进乳腺导管内原位癌发展成为侵袭性乳腺癌[9]。COX-2是前列腺素E2 （PGE2）合成的诱导酶， PGE2是参与炎症反应的重要介质，可促进炎症反应和组织受损[10]。肿瘤组织高表达COX-2可使病理性PGE2合成大量增加，促进了炎症反应和组织损伤。且PGE2可与伤害性感受器相应受体结合，参与癌症痛痛觉过敏的形成[11]。因此，COX-2在乳腺癌发生发展和癌痛形成过程中起重要作用。王氏等[12]采用选择性COX-2抑制剂塞来昔布治疗MRMT-1乳腺癌细胞诱导的骨癌痛大鼠，取得了良好效果，研究结果表明塞来昔布对该骨癌痛模型具有镇痛和抗肿瘤作用，能减轻骨质破坏程度，诱导肿瘤细胞凋亡、坏死。近年来的研究结果表明，血管内皮生长因子（VEGF）是一种与实体瘤生长和转移最为密切的血管形成调节因子，且和COX-2有共表达的现象[13]。乳腺癌组织中COX-2的高表达可上调VEGF水平，促进新生血管形成，抑制癌细胞凋亡，促进癌细胞增殖，从而促进肿瘤的发生和发展[14]。
本研究结果显示，槐定碱治疗组较模型组大鼠机械性痛阈和热痛阈值显著提高（P
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Study on effect of sophoridine against bone cancer pain and its mechanism
YAN Ji-gui*， YANG Yu-qing， WANG Ya-jie， KAN Jing
（Department of Pharmacy， Anhui Medical College， Hefei 230601， China）
[Abstract] Objective： To study the effect of sophoridine against bone cancer pain in bone cancer pain model rats induced by W256 tumor cells and its mechanism. Method： The rat model of bone cancer pain was reproduced by injecting W256 tumor cells into the rat marrow cavity. Ten days after the model establishment， 36 rats were selected and randomly divided into the model control group and the sophoridine treated group. At the same time， other 10 rats with sham-operation were selected to be the normal control group. Since the 15th day after the operation， rats in the treated group had been given sophoridine （25 mg・kg-1） for 10 days. The mechanical withdrawal threshold and the thermal withdrawal latency of each group were measured before and after the treatment. After the last treatment， the radiological and histopathological observation shall be conducted for sick legs of all rats. The expressions of cyclooxygenase-2 （COX-2） and vascular endothelial growth factor （VEGF） in tumor tissues were detected by mmunohistochemistry. Result： Sophoridine could significantly increase the mechanical withdrawal threshold and the thermal withdrawal latency （P
[Key words] sophoridine； W256 tumor cell； bone cancer pain； cyclooxygenase-2； vascular endothelial growth factor
doi：10.4268/cjcmm20132329