晚期糖基化终末产物受体在2型糖尿病大鼠种植体骨结合中的表达

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[摘要] 目的 探讨晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)及其受体影响种植体骨结合的可能机制。方法 建立2型糖尿病大鼠模型,随机分为正常对照组、糖尿病对照组、正常种植组、糖尿病种植组,分别于正常种植组和糖尿病种植组胫骨近骺端植入纯钛种植体,于植入8周后下腔静脉采血处死大鼠,用Hitachi2850型荧光分光光度计测定血清中AGEs含量的变化,取种植侧胫骨拍X线片和骨密度测量,并制作病理标本,采用免疫组化检测种植体周围晚期糖基化终末产物受体(RAGE)的表达并作图像分析。结果 4周后,糖尿病种植组和糖尿病对照组与正常对照组和正常种植组比较,骨质疏松明显,胫骨BMD明显下降,血清中AGEs含量增多;糖尿病对照组和正常对照组骨组织RAGE蛋白的阳性表达强度分别低于前两组。图像分析阳性细胞率和阳性细胞平均光密度值结果,糖尿病种植组明显高于正常种植组,糖尿病对照组明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P

[关键词] 种植体骨结合; 骨密度; 晚期糖基化终末产物; 晚期糖基化终末产物受体

[中图分类号] R782.12 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2010)15-09-03

The Expression of Advanced Glycation End Product Receptor in Implant Osseointegration of Type 2 Diabetic Rats

MENG Bing JIAO Yanjun LI Lin SUN Xiaojun

Department of Stomatology,the First Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China

[Abstract] ObjectiveTo explore the mechanism possible that advanced glycation end products(AGEs)and their receptors affect the implant osseous integration. MethodsEstablish a rat model of type 2 diabetes,then divided them into normal control group,diabetic control group,normal planting group,diabetes planting groups randomly,the diabetic planting group and the normal planting group were implanted the titanium implant near the epiphyseal end of tibia. 8 weeks later,collect the inferior vena cava blood,test the serum AGEs levels in the changes by fluorescence spectrophotometer Hitachi2850,shoot lateral tibial X-ray films,the the bone mineral measurements density,and make the production of pathological specimens,detect the expression of RAGE using immunohistochmecal method. Results8 weeks later,diabetes planting group and the diabetic control group expressed significant osteop-orosis,tibial BMD decreased and serum levels of AGEs increased,the expression of RAGE protein in bone tissue was stronger than the other two groups. Thers is statistically significant difference between each two groups(P

[Key words]Osseointegration; BMD; AGEs; RAGE

骨整合是口腔种植的生物学基础。研究发现糖尿病(diabetes mellitus,DM)患者口腔种植成功率较正常人群低,且更容易发生周围牙槽骨的吸收[1];动物实验结果显示DM动物植入种植体后,种植体和骨组织的结合水平显著下降[2]。但DM影响种植骨整合的具体机制还不清楚,其因素多而复杂。本研究在建立大鼠2型DM模型的基础上,比较正常大鼠与DM大鼠胫骨种植后周围骨组织中RAGE的表达变化。

1 资料和方法

1.1 一般资料

1.1.1 药物 链脲佐菌素(streptozotocin,STZ;美国Sigma公司),柠檬酸溶液,纯钛种植体(1.3mm×7mm,江苏中邦)。

1.1.2 动物 2月龄SD雄性健康大鼠45只,体重170～230g,由山西省中医研究所提供。

1.1.3 主要仪器 one Touchп快速血糖仪(美国强生公司),Lunar Prodigy双能X线骨密度仪(美国Lunar公司),LEICA RM2235切片机(德国Leica公司),荧光分光光度计(Hitachi 2850型),抗RAGE多克隆抗体(武汉博士德公司);Axioskop2 plus显微镜及图像分析系统(德国ZEISS公司)。

1.2 方法

1.2.1 2型DM模型制备 所有大鼠适应性喂养1周后,禁食12h,随机分为DM模型组和正常组。DM模型组高糖高脂饮食四周后,腹腔内一次性注射枸橼酸钠链脲佐菌素溶液30mg/kg。标准饮食连续喂养2周,血糖值>16.7mmol/L视为建模成功[3],否则予以剔除。正常组则注射等量枸橼酸钠溶液。22只大鼠血糖达到标准,剩余3只未达到上述标准被淘汰。饲养过程中模型组大鼠死亡2只。将20只建模成功的大鼠分为DM组对照组和DM种植组,每组10只。将20只正常组大鼠分为正常对照组和正常种植组,每组10只。

1.2.2 种植体植入 4%戊巴比妥钠(1mL/kg)腹腔注射麻醉两组种植大鼠,显效后将大鼠仰卧固定于手术台上,两侧下肢备皮消毒,切开皮肤、皮下组织,在右侧胫骨近骺端用直径1.3mm齿科钻在生理盐水冷却下形成种植体窝,然后将纯钛种植体植入。术区给予青霉素粉剂,对位缝合伤口。对照组行假手术。术后基础饲料喂养。

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1.2.3 样品采集 8周后禁食12h后,测血糖、体重,下腔静脉采血处死大鼠。取下种植体,剔除包括骨膜在内的所有软组织,每组取大鼠的右侧胫骨行骨密度测量和X线拍片,10%中性缓冲福尔马林液固定,EDTA脱钙,乙醇逐级脱水,石蜡包埋,取种植体周围5mm的骨组织进行5μm切片。用Hitachi2850型荧光分光光度计测定血清中AGE的含量。

1.2.4 骨密度测定 剔胫骨表面的软组织,以Lunar Prodigy双能X线骨密度仪测定右侧胫骨种植体的骨矿物密度[4]。

1.2.5 骨组织RAGE免疫组织化学染色及图像分析 按RAGE免疫组化染色试剂盒说明书操作,常规脱水、透明、中性树脂封片。在显微镜下对免疫组化结果进行观察。用Axioskop2 plus图像分析系统对RAGE阳性细胞率和阳性细胞平均光密度值作定量分析。

1.3 统计学处理

统计软件SPSS13.0行数据分析,结果以(χ±s)表示。采用方差分析,组间比较用LSD法。P

2 结果

2.1 种植体愈合情况

20只种植大鼠均健康存活,创口愈合良好。种植体均未出现松动、两例DM种植组大鼠种植区皮下组织出现脓液。其余未见红肿破溃。

2.2 胰岛素对DM大鼠种植体BMD、血清中AGE、血糖和体重的影响

DM组和正常对照组及DM种植组和正常种植组骨BMD、血清中AGE、血糖及体重变化的比较均有统计学意义(P

2.3 X线片观察的结果

DM种植组种植体周围胫骨骨皮质较正常种植组薄,部分出现吸收、骨髓腔变宽、松质骨骨纹理稀疏变细(封三图1)。正常种植组种植体周围胫骨皮质骨密度较均匀,骨髓腔较DM组窄,松质骨骨纹理致密而粗细均匀(封三图2)。DM种植组种植体周围骨组织表现为较低密度的影像。

2.4 免疫组化检测及图像分析结果

(1)四组大鼠胫骨周围骨组织均检测到RAGE的阳性表达。糖尿病种植组大鼠种植体周围骨组织RAGE蛋白表达强烈且广泛,染色深,有的甚至成片状(封三图3)。正常种植组亦出现RAGE蛋白的阳性表达,但均散在且淡染(封三图4)。糖尿病对照组和正常对照组骨组织RAGE蛋白的阳性表达强度分别低于前两组(封三图5、图6)。

(2)PBS组作为一抗阴性对照组,四组大鼠骨组织均未检测到RAGE的表达。

(3)图像分析RAGE阳性细胞率和阳性细胞平均光密度值结果示:糖尿病种植组明显高于正常种植组,差异有统计学意义(P

3 讨论

牙种植修复已经成为一种重要的缺牙修复方式。然而DM患者的种植修复失败率往往较高,初期骨结合较差。文献表明,2型DM会影响大鼠皮质骨区的骨再生(折裂修复时产生的),这种再生是由骨外膜干细胞通过膜内和软骨内的骨分化而形成新骨[5]。而2型DM会干扰骨重建的整个过程,使骨折愈合延迟,骨组织的生物机械学强度下降[6]。另外,DM还使成骨能力发生缺陷,包括骨矿化和基质形成的减少或延迟[7]。

糖尿病患者持续的高血糖,可与机体多种蛋白成分发生糖基化反应,最终生成AGEs,是糖尿病病理变化的一个特征。目前已经确认的与AGEs结合的受体包括糖基化终末产物受体(RAGE)、Ⅰ型和Ⅱ型清道夫受体、寡糖转移酶48、80K2H磷酸蛋白和半乳糖结合蛋白[8,9],RAGE是与AGEs结合的主要受体。有研究表明在糖尿病动物的颅盖骨组织间充质细胞、成骨细胞中,RAGE的表达上调,应用RAGE的配体可以导致骨形成抑制,并随着剂量的增加,抑制作用增强[10,11],从而影响骨重建。

本研究结果表明,2型DM大鼠血清中AGEs含量明显升高,种植体周围骨密度影像则明显低于正常种植组,胫骨骨皮质菲薄,部分吸收,骨髓腔增宽,松质骨骨纹理稀疏、变细。2型DM大鼠种植体周围骨组织RAGE蛋白表达较对照组强烈且广泛,染色深甚至成片状,明显高于对照组。图像分析阳性细胞率和阳性细胞平均光密度值也明显高于对照组。因此有理由认为,AGEs-RAGE途径是2型DM影响种植体骨结合的机制之一。

[参考文献]

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[9] Thornalley PT. Cell activation by glycated proteins,AGE receptors,receptor recognition factors and functional classification of AGEs[J]. Cell Mol Biol,1998,44(7):1013-1023.

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(收稿日期:2010-03-16)

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