神经胶质瘤细胞对血管新生作用及其血管生成素-2表达的影响

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[摘要] 目的：探讨人神经胶质瘤细胞对血管新生的影响及作用机制。方法：体外分离培养人神经胶质瘤细胞， 用免疫细胞化学法检测不同级别的肿瘤细胞中血管生成素-2的表达，采用图像分析软件进行光密度(IOD)的测量；培养人脐带静脉内皮细胞并应用Matrigel建立血管形成的体外培养体系，检测肿瘤细胞对血管新生的影响。结果：血管生成素-2在神经胶质瘤细胞中的表达强度与瘤组织的分级呈正相关(P

[关键词] 肿瘤；血管新生；血管内皮生长因子；血管生成素

[中图分类号] R364.3[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2008）05（a）-014-03

Facilitating the neogenesis of blood vessels of gilomas cells and its effection on expression of angiogenin-2

LI Bao-yue1, LIU Zheng-cao2, YAO Qi1, GU Su-ning1

(1.Department of Pathology,Shenyang No.7 People's Hospital, Shenyang110003, China; 2. Department of Pathology,Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang110003, China )

[Abstract] Objective: To discuss the influence of the role of human neurospongioma cells infacilitating human vascular endothelial cells and expression of neurospongioma angiogenin-2.Methods:HUVECs were cultured by modified Jaffe methods and induced to develop tubular structure by Matrigel.Thus set up a stable angiogenesis system and added the stimulating factor.Neurospongioma cells were fractional cultivated in vitro and the expression of Ang-2 protein was detected by immuncytochemical methods. Finally the date was analyzed by statistics.Results:HUVECs could be induced to form tubular structure by Matrigel in vitro. After treatment with the conditional medium of tumor cells, the number of tubules increased in a dose-dependent manner. The expression of Ang-2 increased in neurospongioma cells.Conclusion:Angiogenesis can be induced by neurospongioma cells;the expression of Ang-2 in neurospongioma upregulates and in positive correlation with grade of tumor.

[Key words] Tumor; Angiogenesis;Vascular endothelial growth factor；Angiogenin

恶性胶质瘤是人类最常见的原发性脑肿瘤，具有高度依赖的血管新生，有明显的微血管增殖和血管生成本质[1]。血管生成素(Ang)一族通过上调数个靶基因在肿瘤的发生和肿瘤血管新生中起着关键性的作用。本实验在体外培养人脐带静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）和人神经胶质瘤细胞，应用Matrigel建立血管形成的体外培养体系，研究肿瘤细胞对血管新生的影响及肿瘤细胞中血管生成素的表达，进而探讨神经胶质瘤细胞对肿瘤血管新生的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1．1材料

脐带来源于健康新生儿；神经胶质瘤组织来源于总医院2005年11月～2007年1月神经胶质瘤切除手术；正常脑组织来源于动－静脉畸形手术切除手术。DMEM培养液、胰蛋白酶购于美国Sigma公司，胎牛血清购于天津生物化学制品厂；GFAP多克隆抗体购于迈新生物技术有限公司，Ang-2多克隆抗体购于武汉博士得生物工程有限公司。

1.2分组

实验分两部分，第一部分观察HUVECs在Matrigel上形成管腔结构的情况。分为对照组（无血清DMEM培养液）和实验组，即不同浓度的肿瘤细胞条件培养液作用组（肿瘤细胞上清液与DMEM培养液比分别为1∶2、1∶1、2∶1）。第二部分检测Ang-2蛋白的表达，分3组，第1组为对照组8例（正常脑神经胶质细胞），第2组10例Ⅰ级～Ⅳ级人神经胶质瘤细胞，第3组12例 Ⅲ~Ⅳ级人神经胶质瘤细胞。

1．3 方法

1.3.1 细胞培养与鉴定

1.3.1.1人脐带静脉内皮细胞（HUVECs）采用改进的Jaffe方法培养。鉴定：人脐带静脉内皮细胞（HUVECs）在倒置相差显微镜下细胞形成单层铺路石样；在Matrigel上培养形成管腔样结构。

1.3.1.2神经胶质瘤细胞手术切除的新鲜无菌人神经胶质瘤组织，剪碎，胰酶消化，滤网过滤，离心，加入20％胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液，接种培养皿中。置于37℃ 含有5％ CO2孵箱内，3 d换液。鉴定：采用S-P免疫细胞化学法，步骤见试剂盒说明书，GFAP免疫组化染色阳性。细胞用95％冰乙醇固定1 h以上，PBS冲洗（10 min×3次），每张玻片加1滴过氧化氢阻断剂，室温10 min，PBS冲洗（10 min×3次），每张玻片加1滴非免疫性动物血清，室温10 min，每张玻片加1滴一抗（兔抗人Ang-2多克隆抗体），4℃过夜。PBS冲洗（3 min×3次），每张玻片加1滴生物素标记二抗，室温10 min，PBS冲洗（10 min×3次），每张玻片加1滴链亲和－过氧化物酶溶液，室温10 min，PBS冲洗（10 min×3次），DAB显色，5~10 min，蒸馏水冲洗，苏木素复染，自来水冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.3.1.3正常人神经胶质细胞标本取自动－静脉畸形手术切除正常脑组织，方法与鉴定同上。

1.3.2 肿瘤细胞条件培养液的制备将培养达亚融合状态的神经胶质瘤细胞弃去培养液，加入不含血清的培养液6 h后，收集培养上清与DMEM 培养液分别以1∶2、1∶1、2∶1比例混合作为不同浓度的肿瘤细胞条件培养液。

1.3.3 胶质瘤细胞血管生成素-2的表达用免疫细胞化学法检测培养的正常神经胶质细胞和神经胶质瘤细胞中血管生成素-2的表达。积分光密度（IOD）的测定：每个玻片取5个视野，用图像分析软件分析其光密度。

1.3.4 血管腔样结构形成的检测将Matrigel涂于无菌24孔板的玻片上，内皮细胞制成悬液接种在玻片上，对照组为无血清DMEM培养液，实验组取不同浓度的肿瘤细胞条件培养液（肿瘤细胞上清液与DMEM 培养液之比分别为1∶2、1∶1、2∶1）作用24 h。光镜下观察，内皮细胞连接形成C形即为一个管腔，低倍镜（40×）下取3处管腔密集的视野，在每个放大（100×）的视野计数管腔数。

1.4 统计学方法

实验数据以均数±标准差表示，多组均数间的比较采用F检验。P

2 结果

2.1 分离培养的神经胶质瘤细胞的鉴定

GFAP免疫细胞化学法检查，细胞胞浆和核膜周围被染成棕褐色，细胞核呈蓝色（图1）。

2.2 对照组和不同浓度神经胶质瘤细胞条件培养液分别作用24 h后形成管腔情况

对照组形成管腔数较少，肿瘤细胞上清液与DMEM 培养液比为1∶2时作用24 h形成的管腔数有增多的趋势，肿瘤细胞上清液与DMEM 培养液比为1∶1时作用24 h形成的管腔数显著增多（P

2.3 Ang-2在不同级别神经胶质瘤细胞中的表达

正常脑神经胶质细胞中不表达Ang-2；22例神经胶质癌患者的神经胶质瘤细胞中均有Ang-2蛋白表达，低级别神经胶质瘤细胞中表达较低；高级别肿瘤细胞中表达较高。不同级别间的表达差异有显著性（F=184.124，P

3讨论

恶性胶质瘤是一类富含血管并能诱发大量病理血管生成的肿瘤， 具有明显的微血管增殖和血管生成本质，这些新生血管有可能成为瘤细胞演进和扩散的引导结构。本文通过对Ang-2的表达及肿瘤细胞自身对血管新生的研究，对它们参与胶质瘤血管形成及之间的相互作用有了进一步的认识，对于它们与胶质瘤恶性生物学行为之间的关系，也有了一些新的看法。

肿瘤血管形成（neovascularization）是指肿瘤细胞诱导的毛细血管生长及肿瘤血液循环建立的过程，是实体肿瘤生长、侵袭、扩散和转移的关键。肿瘤血管生成有两种方式[2，3]，血管新生（angiogenesis）和血管发生（vasculogwnesis）。这个过程受多种促进血管生成因子及抑制因子的作用，并有多种酶、细胞黏附分子的参与[4]。在体内，肿瘤血管新生因子主要来源于肿瘤细胞分泌释放的多种活性因子，如血管内皮细胞生长因子（VEGF）、血管生成素（Angs）、肿瘤坏死因子（TNF）等。Angs（angiogenin）家族有Ang-1，Ang-2，Ang-3，Ang-4四位成员，所起作用各自不同。Ang-2功能主要是通过竞争性抑制Ang-1与Tie-2受体结合，从而抑制管壁周围细胞聚集，使血管壁的可塑性增加，并与VEGF存在协同作用[5，6]，在缺氧环境下肿瘤细胞分泌更多的VEGF和 Ang-2，通过促进PAF等炎性因子的产生及下调细胞黏附分子PECAM-1和VE-Adherin的表达[7]，从而形成不稳定渗透性血管，促进坏死肿瘤周围新生血管的形成[8，9]。Ang-2在宿主内皮细胞表达增加，表现周细胞丧失，肿瘤血管不稳定[10]。

肿瘤的血管新生是受血管新生因子和血管新生抑制因子的调节。在体内，肿瘤的血管新生因子主要来源于肿瘤细胞，由肿瘤细胞释放，作用于血管内皮细胞，促其增生形成新生血管。本实验观察到肿瘤条件培养液作用于培养的HUVECs后培养体系的管腔数增多，且在一定范围内呈浓度依赖效应。推测肿瘤细胞可通过分泌某些促血管新生因子促进肿瘤血管新生，同时我们检测到不同级别的神经胶质瘤细胞中Ang-2的表达增强与肿瘤级别呈正相关，说明其在神经胶质瘤的血管新生过程中发挥一定的作用。神经胶质瘤是一种较常见的颅脑肿瘤，深入研究血管新生过程及相关因子，从而研制抑制肿瘤血管新生的靶标，进而抑制肿瘤的生长与转移，在临床上与手术治疗和放、化疗相结合，将为神经胶质瘤的治疗和预防开辟新途径。

[参考文献]

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[8]Holash J, Wiegand SJ, Yancopoulos GD. New model of tumor amgiogenesis:dynamic balance between vessel regression and growth mediated by angio-poietins and VEGF[J]. Oncogene, 1999, 18: 5356-5362.

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[10]Hu B, Guo P, Fang Q, et al.Angiopoietin-2 induces human glioma invasion through the activation of matrix metalloprotease-2[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2003, 100(15): 8904-8909.

（收稿日期：2007-12-17）

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