RASSF1A基因在膀胱移行细胞癌中转录表达和启动子甲基化的研究

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用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术鉴测37例膀胱移行细胞癌(bladder transitional cell Carcinoma,BTCC)组织和8例正常膀胱组织中rassf1a基因mRNA表达水平;用甲基化特异性PCR(Methylation-Specific PCR,MSP)。方法 研究膀胱移行细胞癌组织和正常膀胱组织中的RASSF1A基因启动子区CPG岛甲基化状态。结果 RASSF1AmRNA在8份正常膀胱组织中全部表达,在BTCC组织中的表达率为35.1%(13/37),二组间表达差异有显著性(P0.05)。在正常膀胱组织中RASSF1A基因启动子未发生甲基化,但在BTCC组织中RASSF1A基因启动子甲基化频率为51.3%(19/37)。二组间表达差异有显著性(P

【关键词】膀胱移行细胞癌;DNA甲基化;聚合酶链反应;RASSF1A基因

【Abstract】Objective To investigate the expression of RASSF1A mRNA and promoter hypermethylation of RASSF1A gene in bladder transitional cell Carcinoma and to analyze the association between them. Methods RASSF1A mRNA expression level was measured by semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) in 8 normal bladder tissues and 37 BTCC tissues. The promoter methylation status of RASSF1A gene in BTCC and normal bladder tissues were tested by MSP. Results RASSF1A mRNA were all shown in 8 normal bladder tissues and the expression rate is 35.1% (13/37) in BTCC tissues. There was significantly different between the two groups (P0.05). The frequence of promoter methylation of RASSF1A gene was 51.3% (19/37) in BTCC tissues. But it was not found that the promoter methylation in normal bladder tissues. Amoung the 19 patients with the aberrant methylation,16 showed the loss .expression of RASSF1A mRNA . Conclusion Promoter aberrant hypermethylation may Contribute to the loss or low level of RASSF1A mRNA expression and the genesis of bladder tumor. However,it may be has no correlation with the invasiveness of tumor.

【Key words】Bladder transitional cell carcinoma; DNA methylation; Polymerase chain reaction; RAS association domain family 1A gene

Ras相关区域家族1A(Ras association domain family1A gene,RASSF1A)是2000年从3号染色体短臂上克隆出来的新型肿瘤抑制基因,位于人类染色体3p21.3位点[1],其抑癌机制研究仍处于初级阶段,且国内报道甚少。本研究采用未定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法研究RASSF1AmRNA在膀胱细胞癌组织、正常膀胱组织中的表达,同时观察该基因启动子甲基化状态,分析基因表达与启动子甲基化及与肿瘤发生、发展的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料收集郑州大学一附院及中牟县人民医院泌尿外科2007年10月至2009年6月住院病人的膀胱移行细胞癌新鲜手术切除标本37例,男31例,女6例。年龄37～81岁,平均68.4岁,病理分级I级11例,II级18例,III级8例。TNM分期,浅表性(Ta-T1)16例,浸润性(T2-T4)21例。全部标本均经病理证实。连同8例距离肿瘤边缘2cm以远的正常膀胱组织。组织取出后立即投入液氮罐内,-70℃冰箱保存备用。

1.2 组织标本总RNA提取、CDNA合成及PCR扩增

(1)组织标本总RNA提取:取1g左右的新鲜组织加1ml Trizol,匀浆后,依次离心,加氯仿、离心,加异丙醇,取上清液、离心,加入DEPC水,轻弹混匀。

(2)CDNA合成:采用20ul反应体系,包括总RNA5ug、Oligo(dt)18引物1ul、5xbuffer液4ul、10mmol/L dNTP混合液1ul,逆转录酶1ul。反应条件:65℃5min,42℃2min,42℃50min,70℃15min,反应后产物迅速放入冰内保存。(3)PCR扩增:反应总体积25ul,其中含cDNA样本0.5ul,primer1(10uM)1ul,primer2(10uM)1ul,10xbuffer2.5ul,Mg2+(25mM)1.5ml,dNTP(2mM)2.5ul,TagDNA聚合酶0.5ul,H2O15.5ul。设计的引物序列见表1,扩增条件:94℃变性5min,然后按94℃×30S,57℃×30S,72℃×1min,进行30个循环,最后一个循环72℃延伸10min,反应结束后产物放入冰内保存。

1.3 组织标本总DNA提取及MSP按照DNA提取试剂盒说明抽提新鲜组织中基因组DNA后,按修饰试剂盒说明将基因组DNA进行甲基化修饰。修饰后的DNA-20℃贮存备用。

甲基化引物和非甲基化引物序列见表1,每个PCR反应体系为25ul。内含:样本DNA5ul(1ug),1×PCRbuffer2ul,2mMmgl 2ul,0.25uM dNTPs6.25ul,1uM各种引物各1ul,1u Taq DNA polymerase 1ul,H2O 6.75ul。反应条件:95℃变性5min,然后按95℃×30S,60℃×45S,72℃×45S,进行40个循环,最后72℃延伸10min。反应结束后产物放入冰内保存。

1.4 PCR产物分析(1)RT-PCRPCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳35分钟,电压90伏。阳性结果为RASSF1A基因RT-PCR引物扩增出的300bp的条带。(2)MPS:PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳1小时,电压40伏,阳性结果为RASSF1A基因甲基化引物扩增出的94bp的条带和非甲基化引物扩增出的108bp的条带。

1.5 统计学方法采用X2检验以及fisher精确概率算法,以P

2 结 果

2.1 8例正常膀胱组织中的RASSF1AmRNA全部表达,表达率100%(8/8),在TCC组织中表达率为35.1(13/13),两者间的表达差异有显著性(P

3 讨 论

RASSF1A基因作为一种肿瘤抑制基因,参与Ras/RASSF1A/ERK通路的信号传导,通过抑制Ras激活生长效应信号的传导途径,使其丧失抑制生长,促进凋亡和衰老的功能而发挥抑制肿瘤发生的作用,其功能失活将导致对肿瘤的抑制作用丧失。我们在实验中观察发现RASSF1A mRNA在BTCC组织中的表达缺失率高达76.8%(28/37),而在相对应的癌旁正常组织中则全部表达,二者的表达差异有显著性(P

RASSF1A作为抑癌基因,在抑制肿瘤发生和发展中的作用机制还不十分清楚,目前存在两种观点。一种可能是:RASSF1A通过Rb家族的细胞周期检查点的作用而诱导细胞周期的停滞。在研究中发现,RASSF1A可以抑制内源性cyclin D1的积聚而诱导细胞周期停滞于G1/S期转换点。但是cyclin D1其下游激活因子自表达的增多又可抑制RASSF1A诱导细胞周期停滞。因此,RASSF1A作为抑癌基因,它的转录因子在细胞周期的G1/S期调控细胞增殖[3]。另一种可能是,活化的Ras癌蛋白在细胞中也许起了双重作用,通过效应蛋白,一方面促进细胞生长和转化;另一方面它又促进细胞的凋亡、衰老、坏死和终末分化。而RASSF1A基因可能就是编码看Ras后一种作用的特有的效应蛋白,它的失活破坏了Ras的平衡作用,导致了细胞的恶性转化[4]。

既往已有研究发现,在不表达RASSF1A的肿瘤细胞株中,用DNA甲基转移酶抑制剂5-氮-2-脱氧胞苷(5’-aza～2’-deoxycytidine)脱甲基处理后,可激活RASSF1A的再表达,并可抑制肿瘤细胞系在塑料盘和非贴壁的软琼脂上的生长。而cheng等[5]通过小鼠实验发现,DNA甲基化抑制药物zebularine经注射或口服后,小鼠的肿瘤显著缩小。RASSF1A mRNA在膀胱移行细胞癌组织中表达量的下降和启动子区异常高甲基化提示:如果使用去甲基化药物能恢复RASSF1A基因表达,抑制肿瘤的生长,那么,本研究也就为膀胱移行细胞癌患者的治疗提供了一条新的途径。

【参考文献】

[1] Dammann R,Li C,Yoon JH,et al. Epigenetic inactivation of a RAS association domain family protein from the lung tumor suppressor Locus Genet,2005,25:315-319.

[2] Issa JP,Aging EA. DNA methylation and cancer. Crit Rev Oncol Hematol,2006,32:31-34.

[3] Shivakumar L,Sakamaki T,et al. The RASSF1A tumor suppressor block cell cycle progression and inhibits cyclin D1 accumulation. Mol Cell Biol,2002,22(12):4309-4318.

[4] Vos MD,Ellis CA,Bell A,et al. Ras use the novel tumor suppressor RASSF1A as an effector to mediate apoptosis. J Biol Chem,2006,275:35669-35672.

[5] Cheng JC,Matsen CB,Gonzales FA,et al. Inhibition of DNA methylation and reactivation of silenced genes by zebularime. J Natl Cancer Inst,2003,95:399-409.