利用SSR分子标记鉴定杂交稻种子齐两优918纯度

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摘要：种子纯度是杂交水稻种子质量的核心指标。微卫星技术（SSR分子标记技术）因其具有稳定性好、准确可靠、易于操作等优点在种子纯度鉴定中得到了越来越广泛的应用。采用48个SSR分子标记对杂交水稻组合齐两优918的双亲及F1之间的多态性进行筛选和纯度检测技术研究，为种子生产以及种子上市销售做好质量监督，杜绝质量风险。经过筛选得到如下结果：在对48对引物进行筛选后，发现有5对引物在双亲间显示稳定多态性，在杂种F1上表现为父母本共显性条带，表明该5对引物适宜于齐两优918杂交种子纯度鉴定，可用于种子质量监控。

关键词：杂交水稻；种子纯度鉴定；微卫星分子标记（SSR分子标记）

中图分类号 S511 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）17-120-02

种子纯度是杂交水稻种子质量的核心指标，是种子质量分级的主要标准，是企业购销种子的关键依据，历来受到种子管理部门、种子企业和农民的密切关注。而无论三系还是两系杂交稻，高纯度杂交种都是发挥杂种优势增产潜力的基础，种子纯度不够会给种植户造成减产和巨大的经济损失。

品种纯度检验的方法很多，根据其所依据的原理不同主要分为形态鉴定、物理化学法鉴定、生理生化法鉴定、分子生物学方法鉴定、细胞学方法鉴定。其中分子测定技术又分为RFLP、AFLP、RAPD、SSR分子检测技术。而SSR（Simple Sequence Repeats，简单重复序列）分子技术是近年来发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，也称为微卫星DNA （Microsatellite DNA）技术，其SSR标记是一类由几个核苷酸（一般为1～6个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，具有以下优点：（1）数量丰富，覆盖了整个基因组，揭示的多态性高；（2）具有多等位基因的特性，提供的信息量高；（3）以孟德尔方式进行遗传，呈共显性；（4）每个位点由设计的引物顺序决定，便于不同的实验室之间相互交流合作开发特异性引物。因而SSR分子检测技术在种子纯度鉴定中得到了广泛应用。

笔者利用ssr分子检测技术，对齐两优918母本033S和父本R918进行扩增反应和电泳图谱的分析，结果选出了5对引物，这5对引物对齐两优918的母本033S和父本R918都显示出了很好的多态性，并在齐两优918上显示出共显性特征，因此适宜于对其进行纯度鉴定以及质量监控。

1 材料与方法

1.1 实验材料 水稻种子齐两优918的不育系033S在光照培养箱（恒温30℃）中培养生长7d的幼苗；恢复系R918在光照培养箱（恒温30℃）中培养生长7d的幼苗；杂交种（F1）齐两优918在光照培养箱（恒温30℃）中培养生长7d的幼苗。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA的提取 DNA的提取采用CTAB法：取一棵幼苗，用剪刀剪碎后放在2.0mL的离心管中，加入液氮，研至粉状即可，然后在离心管中加入600μL的裂解液，把离心管盖好放在65℃的水浴锅里预热30min，期间要每隔10min反复颠倒几次。预热后加入氯仿：异戊醇抽提液600μL，把离心管盖好放入低温高速冷冻离心机中以13 000r/min离心15～20min，然后把上清液转移到1.5mL的离心管中，加入1/10体积的醋酸钠和2倍体积的无水乙醇，再放入离心机中以13 000r/min离心5min，倒出上清液，这时在底部就可以看到白色透明沉淀。再加入500μL的70%乙醇，离心2min，开盖后将底部白色沉淀风干即可，加入100μL的TE缓冲溶液，-20℃保存备用。

1.2.2 PCR反应 PCR反应体系为：10×Buffer倍液，dNTP 0.12mmol/L，Mg2+ 1.5mmol/L，每种引物1μmol/L，0.2单位Taq酶，10ng的DNA，不足10μL的部分用超纯水补足（共计10μL）。

PCR反应程序为：95℃预变性5min，然后94℃ 1min，56℃ 30s，72℃ 30s，进行35个循环，再在72℃延伸7min。最后冷却至4℃。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 把电泳槽装好后在底部用1%的琼脂凝胶封底，用聚丙烯酰胺凝胶溶液（8%的聚丙烯酰胺溶液+0.5%体积的10%过硫酸铵溶液+0.1%的TEMED）灌胶，快速插入梳子。在PCR扩增反应产物中加入溴酚蓝指示剂，待胶凝固后进行点样。按正负极接通电泳仪后，180～200V的电压下跑电泳2.5h左右。将胶放入固定液（体积比0.5%乙酸和体积比10%的乙醇）中固定12min，然后倒去固定液，用染色液（AgNO3溶液）染色12min，倒去染色液，用纯水漂洗2次，每次1～2min。最后将凝胶放入显色液（体积比0.4%的甲醛溶液和质量体积比1.5%的NaOH溶液）中直至条带出现，并拍照记录。

2 结果与分析

齐两优918及其亲本用48对引物进行筛（下转129页）（上接120页）选，有5对引物能在该组合显示稳定的多态性，杂种表现父母本的互补带型。图1分别是选出的5对引物中3对核心引物（P1、P2、P3）在齐两优918双亲及杂交种中表现出来的带型数据。

由图1可知：P1中，M代表20bp lander标准的DNA Marker，1、2、3、4为不育系033S，5、6、7、8为恢复系R918，9、10、12为杂交种，1′、2′、3′、4′为不育系033S，5′、6′、7′、8′为恢复系R918；9′、10′、11′、12′为杂交种。P2中，M代表20bp lander标准的DNA Marker，1、2、3、4为不育系033S，5、6、7、8为恢复系R918，9、10、11为杂交种，1′、2′、3′为不育系033S，4′、5′、6′、7′为恢复系R918，8′、9′、10′为杂交种。P3中，M代表20bp lander标准的DNA Marker，1、2、3为恢复系R918，4、5、6为不育系033S，7、8、9、10、11、12为杂交种。

杂交种纯度鉴定时，一般检测200粒种子，若样品纯度鉴定结果低于96%，将待检测样品数量增加至300粒进行验证。杂交种纯度计算公式为：纯度（%）=杂交种样品数/检测样品数×100。

3 总结与讨论

SSR标记由于具有数量丰富、多态性高、遗传上呈共显性、实验操作简单、结果稳定可靠等优点，已成为杂交水稻种子纯度鉴定的一种理想分子标记。

实验应用CTAB法提取DNA去糖效果好，更是采用了比一般反应体系更小的10μL反应体系，降低了检测成本。但是实验整个DNA提取过程大概需要5h，PCR过程需要130min，丙烯酰胺电泳大概2.5h，整个过程耗时太多，完成一个种子样品的检测大概需要2d，效率太低。以后需要对DNA提取、PCR反应体系和程序及凝胶电泳等方面进行技术体系的优化的研究实验，缩短DNA提取、PCR反应体系和程序的时间，提高工作效率；改丙烯酰胺电泳为琼脂糖电泳，琼脂糖电泳能反复利用，大大降低成本，从而建立准确、简单、快速、成本低廉的鉴定杂交种子纯度的技术体系。 （责编：徐世红）