溶血卵磷脂对血管内皮细胞增殖及凋亡的影响
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【摘要】 目的 观测溶血卵磷脂(LPC)对血管内皮细胞增殖及凋亡的影响,从而探讨动脉硬化发生的机制。方法 取体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，在含不同浓度LPC(5、10、20 mg/L)的培养基中分别培养6、12、24、48 h，用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、流式细胞仪、荧光显微镜观测血管内皮细胞增殖及凋亡的变化。结果 与正常对照组比较，LPC抑制内皮细胞增殖，促进细胞凋亡，且其作用呈时间-效应、浓度-效应依赖关系,但随着LPC浓度增加，细胞凋亡增加的同时细胞死亡比例也增加。结论 LPC抑制血管内皮细胞增殖，促进细胞凋亡，可能是其致动脉粥样硬化机制之一。
【关键词】溶血卵磷脂；人脐静脉内皮细胞；增殖；凋亡
Effects on proliferation and apoptosis of cultured human umbilical vein endothelial cells induced by lysophosphatidylcholine
ZHU Yun,SUN Guo-ju.Department of Geriatrics,the Fifth Affiliation Hospital,Zhengzhou University,Zhengzhou450052 , China
【Abstract】 Objective To investigate the effects on proliferation and apoptosis of HUVECs induced by LPC.Methods HUVECs were treated with different concertrations of LPC (5,10,20 mg/L) for 6,12,24,48 h respectively.Proliferation and apoptosis of HUVECs were assessed by MTT assay,flow cytometry (FCM)and fluorescence microscopy respectively.Results Compared with control group,LPC could inhibit the proliferation and induce apoptosis of HUVECs in a dose-dependent and time- dependent way.Meanwhile,the death of the cells was increased with the increasing of LPC concentration.Conclusion LPC could inhibit the proliferation and induce apoptosis of HUVECs,which may be one of mechanisms responsible for LPC to lead to atherosclerosis.
【Key words】Lysophosphatidylcholine；Human umbilical vein endothelial cells；Proliferation；Apoptosis
血管内皮细胞为衬覆于血管内腔面的单层扁平细胞,它依靠其正常的增殖和凋亡平衡,保证了血管的结构和功能正常。近年来的研究表明，许多心血管疾病的发生发展与细胞增殖和凋亡有关。研究显示：氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)在动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)发生发展中起着重要作用[1-3]，而溶血卵磷脂(LPC)是ox-LDL的主要活性成分。目前，罕见LPC对血管内皮细胞增殖及凋亡影响的研究报道。本研究观测LPC对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响，为AS的基础研究提供新思路。
1 材料和方法
1．1 主要试剂及仪器 RPMI-1640培养基(GIBCO，USA)，胎牛血清(杭州四季青公司)，LPC、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(Sigma，USA)，Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒(深圳晶美生物工程有限公司)，酶联免疫检测仪(Biotek，USA)，荧光显微镜(OLYPUS，JAPAN)，流式细胞仪(BD，USA)，低温离心机(BECKMAN，USA)，高速低温离心机(Eppendorf，USA)。
1．2 细胞株及细胞培养 人脐静脉内皮细胞(Human umbilicus vein endothelial cells，HUVECs)株CRL-1730购自ATCC公司。采用常规培养,将冻存的HUVECs株解冻复苏后，种植在含15%胎牛血清(FBS)、2 mol/l谷氨酰胺、0．1 mg/ml肝素、0．05 mg/ml内皮细胞生长因子的RPMI-1640培养基(Gibco)中，置于37℃、5%的CO2饱和湿度培养箱内培养，以后2～3 d/次换液。待细胞生长至单层融合状态后，用0．25%胰蛋白酶消化传代。实验时所用细胞均为对数生长期。
1．3 设计分组 取对数生长期细胞，按传代方法制成单细胞悬液，进行如下分组：①正常对照组：当细胞长至60%～70%满时换5% 胎牛血清RPMI-1640培养液；②LPC低浓度组：当细胞长至60%～70%满时换含有浓度5 μg/ml LPC的5% 胎牛血清培养液；③LPC中浓度组：当细胞长至60%～70%满时换含有浓度10 μg/ml的LPC的5% 胎牛血清培养液；④LPC高浓度组：当细胞长至60%～70%满时换含有浓度20 μg/ml的LPC的5% 胎牛血清培养液。
1．4 MTT比色法分析非诺贝特对LPC诱导的内皮细胞增殖的影响 取对数生长期细胞，按传代方法制成单细胞悬液，接种于96 孔培养板，每孔加细胞悬液200 μl(相当于2×104个)，按实验要求进行分组及处理。空白对照组以无血清RPMI-1640 补足，细胞终浓度为1×105/m L，每孔总体系0．2 ml，培养时间分别为6、12、24、48 h。每孔加入0．5% MTT 20 μl，继续培养4 h 后，小心吸除孔内液体，每孔加二甲基亚砜150 μl，震荡10 min后，用酶标仪在490 nm波长处测定各孔的吸光度值(A值)。以时间为横轴，A值为纵轴，绘制细胞生长曲线。实验重复3次,设3个复孔,取平均值为最终结果。
1．5 细胞凋亡的形态学观察 将HUVECs 接种于内置多聚赖氨酸处理过的载玻片的6孔板上，根据实验要求进行分组及处理。按细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒(碧云天生物技术研究所)说明书操作，荧光显微镜下观测。
1．6 流式细胞仪观察 对照AnnexinV/FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书操作。取对数生长期细胞，按传代方法制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×104个/ml，接种于6空板上，每孔加细胞悬液1 ml，按实验要求进行分组及处理后，分别收集6孔板各组各孔细胞，调整待测细胞浓度为5×105~1×106个/ ml。取1 ml细胞，1 000 r/min，4℃离心10 min，弃上清。加入1 ml冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮。1 000 r/min，4℃离心10 min，弃上清。重复两次，将细胞重悬于200 μl Binding Buffer，加入10 μl FITC-Annexin V和5 μl PI双标记后，轻轻混匀，避光室温反应15 min，立即上流式细胞仪检测，进行定量分析。
1．7 统计分析方法 实验数据以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS 11．5统计软件，采用t检验、方差分析。以P
2 结果
2．1 LPC对HUVECs细胞增殖的影响 LPC对HUVECs增殖有抑制作用(见图1)。同一时间不同浓度组与正常对照组比较，LPC低浓度(5 μg/ml)即显示对内皮细胞的抑制作用，但以中浓度(10 μg/ml)及高浓度(20 μg/ml)时更加明显，呈浓度-效应依赖关系(P
2．2 LPC对HUVECs细胞凋亡的影响
2．2．1 荧光显微镜观察HUVECs细胞凋亡的形态学变化(Hoechst染色) Hoechst 33258是与DNA特异结合的活性染料。Hoechst 33258染色后，其与染色质特异结合，紫外光激发时发射出明亮的蓝色荧光，荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。正常细胞的细胞核显示为均匀的蓝色荧光。细胞发生凋亡时，染色质固缩，因此荧光显微镜下凋亡细胞的细胞核致密浓染，或呈碎块状致密浓染。LPC孵育后HUVECs凋亡的形态学变化见图2。
2．2．2 LPC对HUVECs凋亡的影响(Annexin V-FITC/PI双染) 应用Annexin V-FITC/PI双染色时，流式细胞术(FCM)可将凋亡细胞区分并定量分析为4个细胞亚群，包括坏死细胞(左上象限：Annexin-/PI+)、正常活细胞(左下象限：Annexin-/PI-)、早期凋亡细胞(右下象限：Annexin+/PI-)和晚期凋亡细胞(右上象限：Annexin+/PI+),总凋亡细胞＝早期凋亡细胞＋晚期凋亡细胞(见图3)。
研究显示：与正常对照组相比，低剂量LPC(5 μg/ml)孵育HUVECs 24 h 后早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞及总凋亡细胞数均明显增加(P
LPC孵育 24 h 后HUVECs细胞死亡数也与LPC浓度有关。与正常对照组相比，LPC低浓度组(5 μg/ml)细胞死亡数无明显改变(P>0．05)，中浓度组(10 μg/ml)及高浓度组(20 μg/ml)细胞死亡数均明显增加(P
3 讨论
血管内皮细胞依靠其正常的增殖和凋亡平衡保持血管结构和功能正常。虽然AS是以增殖为主的血管疾病，但最近的许多研究已经证实细胞凋亡也是AS病变的主要特征[4]。内皮细胞凋亡对AS的发生、发展具有重要意义。早在10年前就有研究者注意到血流的剪切力对AS的影响,发现剪切力低的部位如血管分叉处容易形成粥样斑块,并有内皮细胞更替加快和血管内皮依赖性舒张功能减低。现已证实血流的剪切力对抗内皮细胞凋亡[5],而低剪切力导致内皮细胞凋亡增加可能是AS形成的始动或参与因素之一。研究显示ox-LDL 作为导致AS的关键物质,能诱导体外培养的内皮细胞发生凋亡,显示ox-LDL诱导内皮细胞发生凋亡是其致AS机制之一。总之，血管内皮细胞的增殖和凋亡对心血管系统的许多疾病具有重要意义，因此，本课题探索了LPC对HUVECs增殖及凋亡的影响。
LPC是ox-LDL的主要活性成分，在AS发生发展中起着重要作用[3]。但以前对LPC的研究多局限于氧化应激、平滑肌细胞增殖等方面，罕见其对血管内皮细胞增殖及凋亡影响的报道。本研究以LPC作用于脐静脉内皮细胞，检测其对内皮细胞增殖及凋亡的影响。结果显示：以LPC孵育HUVECs后，HUVECs增殖减弱，凋亡增加，其变化和ox-LDL引起的内皮细胞损伤变化相似，亦和动物实验时的内皮细胞损伤一致。结果还显示LPC对HUVECs增殖及凋亡的影响呈时间-效应、浓度-效应依赖关系。随着LPC孵育HUVECs时间延长，其对内皮细胞增殖的抑制作用增强，以24 h或48 h最为明显；随着LPC浓度增加，其对内皮细胞增殖的抑制作用也增强，呈浓度-效应依赖关系。用不同浓度LPC孵育HUVECs 24 h，随着LPC浓度增加，凋亡增强，但LPC浓度过高时(20 μg/ml)内皮细胞细胞死亡明显增加，推测可能和LPC 对内皮细胞的毒性作用有关。
LPC诱导HUVECs增殖减弱，凋亡增加，从而破坏内皮的完整性，影响内皮的结构和功能，这对AS的发生发展具有重要意义：①血管内皮覆盖的完整性造到破坏，有利于血管平滑肌细胞(VSMC)过渡增殖及迁移至内膜等，促进了动脉粥样硬化的进程；②内皮细胞损伤后内皮下基质和胶原暴露，促进血小板黏附聚集并释放活性物质，导致血栓形成及VSMC增殖；③内皮细胞损伤导致其本身功能障碍，释放NO等活性物质减少，NO具有舒张血管，抑制平滑肌细胞增殖和血小板聚集，减少白细胞黏附，减轻内皮细胞损伤等作用,NO释放减少进一步导致内皮功能障碍及VSMC增殖、增强等，这些因素共同促进了动脉粥样硬化的发生发展。
参考文献
1 Diaz MN,Frei B,Vita JA,et al.Antioxidants and atherosclerotic heart disease.N Engl J Med,1997,337(6):408- 416.
2 Heermeier K,Leicht W,Palmetshofer A,et al.Oxidized LDL suppresses NF-kappaB and overcomes protection from apoptosis in activated endothelial cells.J Am Soc Nephrol,2001,12(3):456- 463.
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