T-cadherin在肝癌中的表达及其对肿瘤侵袭潜能的影响

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【中图分类号】R735.7 【文献标识码】A 【文章编号】1672－3783(2011)12－0259－01

【摘要】目的：探讨T-钙粘素（t-cadherin）在肝癌组织和细胞系中的表达及其对肿瘤侵袭潜能的影响。方法：30例肝细胞癌及其癌旁肝组织标本按肿瘤大小、有无播散灶和远处转移分为高侵袭和低侵袭2组并和同期15例良性肝病肝组织进行比较，分别采用RT-PCR和免疫组化技术等检测T-cadherin的表达水平。另选MHCC97L、MHCC7H和LM3共3株肝癌细胞系进行研究，检测T-cadherin的表达水平，同时应用RNA干扰沉默技术探讨其对侵袭潜能的影响。

结果：高侵袭肝癌T-cadherin的表达水平显著低于低侵袭肝癌（P < 0.05）。MHCC97L、MHCC7H和LM3共3株肝癌细胞系均能表达T-cadherin，其强度随侵袭性增加依次减弱。应用RNA干扰沉默技术能显著地增加肿瘤细胞MHCC97L的侵袭潜能。

结论：T-cadherin在肝癌组织和细胞系中均有表达，其表达强度随侵袭性增强而减弱；T-cadherin在人肝细胞癌中表达下调与肝细胞癌的发生和转移密切相关。

【关键词】T-钙粘素；肝细胞癌；RNA干扰沉默技术；侵袭

Expression levels of T-cadherin in human hepatocellular carcinomas cells influence their invasive potential

FENG LIN, QIU JUN-LAN,PANG ZHI,CAO KAI

【ABSTRACT】Overexpression of T-cadherin (T-cad) transcripts occurs in about 50% of human hepatocellular carcinomas (HCCs). To elucidate T-cad functions in HCC, we examined T-cad protein expression in tumoral human livers and hepatoma cell lines and investigated its influence on invasive potential of HCC using RNA interference silencing of T-cad expression in MHCC97L cells. T-cad expression in metastasis tissue was higher than that in non-netastasis tissue（P < 0.05）. Among three hepatoma cell lines, MHCC97L、MHCC7H and LM3 , T-cad was all detected in tumor cells,but the expression levels was gradually decressed. Matrigel invasion assay revealed that MHCC97L possess a low invasive potential that was significantly increased by T-cad silencing. We propose that T-cad down-expression in tumor cells may play an important role in hepatoma cell invasion and metastasis,it may provide new targets for gene therapy of HCC.

【Key Words】T-cadherin, human hepatocellular carcinomas , RNA interference silencing, cell invasion

肝细胞癌（HCC）是人体最常见的癌症之一，为全球第三大最常见的癌症相关死亡原因［1］。通过改进肝癌的早期诊断技术和外科手术方式对降低死亡率作出了重要的贡献。然而，即使是那些具有较好的临床和病理特点而进行手术切除或肝移植（OLT）治疗的患者，由于肝癌手术后的复发率很高，患者的生存能力仍然很差［2］。肝癌患者的预后较差，主要是受肿瘤原发病灶的侵袭转移所致。对肿瘤复发分子机制更好的认识，将更有效的治疗肝癌患者。此外，对能判定肝癌转移潜能和能预测肿瘤复发的特异分子标志物进行鉴定将有助于确定一部分肝癌患者，对他们来说，可通过OLT进行有效治疗甚至可治愈肝癌［3］。 钙粘素（cadherins）属于跨膜糖蛋白超家族，主要介导钙依赖性的同种细胞间黏附［4］。钙粘素水平的变化与癌症，特别是与其侵袭和转移相关［5］。T -钙粘素（T - cadherin），属于钙粘素超家族中的一种非典型GPI锚定的成员［6］。T -钙粘素基因表达水平的降低与肝癌的进展和预后相关性尚不清楚。本研究探讨T -钙粘素在肝癌组织和细胞系中的表达和分布及其对肿瘤侵袭潜能的影响。

材料与方法

1 组织和细胞:收集2005年1月至2010年12月在我院和苏州大学附属医院经病理学确诊为原发性肝细胞肝癌的手术切除的肝癌30例及其远离癌灶边缘2cm以上的癌旁肝组织标本按肿瘤大小、有无播散灶及远处转移等分为高侵袭和低侵袭2组，并与同期15例良性肝病肝组织进行比较。所取标本部分置于-80℃超低温冰箱中保存，另一部分作石蜡切片，所有诊断均经病理学诊断证实为肝细胞癌。另选3株肝癌细胞系MHCC97L、MHCC7H和LM3进行研究。

2 人肝癌细胞株 人肝癌细胞株MHCC97L、MHCC7H和LM3（三者遗传背景相同，侵袭能力依次增加）由苏州大学细胞生物学教研室惠赠。所有细胞株生长在添加10％胎牛血清，青霉素（100国际单位/毫升）和链霉素（100微克/毫升）的Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基（DMEM培养液）中。

3 免疫组织化学：采用ABC法：组织标本进行4m厚连续切片，常规脱腊、水化，微波修复抗原，抗T-cadherin一抗用PBS以1：100稀释后4℃孵育过夜，二抗37℃孵育30min，ABC 37℃孵育30min，DAB显色，苏木素复染细胞核。PBS代替一抗作为阴性对照。结果判断依据阳性细胞所占百分比进行评分，T-cadherin阳性细胞为细胞膜被染成棕黄色，100倍显微镜下任选10个视野，400倍镜下在每一个视野中连续计数100个癌细胞，记录其中阳性细胞数，取平均数后从0到4评分。0为10%的阳性细胞数，1为11%-30%的阳性细胞数，2为31%-50%的阳性细胞数，3为51%-70%的阳性细胞数，4为70%的阳性细胞数。

4 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）：用TRIzol分别从30例组织标本中提取总RNA，提取方法参照TRIzol试剂盒的说明书进行。用2g的RNA作为模板进行逆转录反应。PCR反应的引物序列按照文献所述［7］。循环过程包括：起始：94℃5min，变性：94℃30min，退火：50℃1min，延伸：72℃1min，共32个循环；最后72℃10min。PCR产物在2%的琼脂糖凝胶电泳中验证。

5 Western blot 方法参照文献进行［8,9］。组织和细胞标本在Laemmli样品缓冲液中进行裂解，使用Bio - Rad公司的蛋白测定仪测定其蛋白浓度。还原条件下，在8％SDS -聚丙烯酰胺凝胶中电泳样品（每泳道80微克蛋白）。电转印将蛋白质转移到硝酸纤维膜（NC）上，用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液37℃下封闭NC膜60min，将兔抗人T-cadherin一抗和β-actin用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液以1：1000和1：200稀释后分别置入含有NC膜的杂交袋中4℃下孵育过夜，TBST缓冲液漂洗数次后，再以1：5000稀释的HRP标记羊抗兔二抗与其孵育，最后用增强化学发光（ECL）进行自显影检测。

6 siRNA转染 使用两种不同的siRNA：T-cadherin siRNA -1（5'GGACCAGUCAAUUCUAAAC3'）和T-cadherin siRNA-2（5'GGAACAAUGACUACUUUUU3'）通过RNAi进行T-cadherin沉默。在转录和蛋白水平对T-cad的表达没有作用的第三种T-cadherin siRNA (5'CUCUGUUCGUC CAUGCACG3')作为对照。接近汇合时的MHCC97L（≈8x106细胞）通过简短的胰酶消化进行收获，洗涤，重悬于400μl无血清的含有siRNA的二聚体（500nM）培养基中。连续两次电转染（300V，960μF，18-22毫秒的时间常数，一个24小时的间隔期）后，细胞在完全培养基中培养和进行适当的恢复以便分析。

7 细胞增殖检测 肝癌细胞株MHCC97L被培养在含有100ml/L的胎牛血清、青霉素和链霉素的DMEM培养液中5x 104个细胞被种植在直径为6cm的18个培养皿中，18个培养皿被分成3组，每组6个皿。培养液每3天换一次，两组细胞在第3、5、7天各计数一次，每次每组选3个皿计数取平均值，每次细胞计数结束，收集细胞做Western Blot分析。8.体外肝癌细胞侵袭检测将Matrigel按40μl/孔均匀的铺在millicell膜上，37℃成胶30min，置紫外灯照射过夜，实验前再次成胶30min，待培养的肿瘤细胞达80%饱和度时，消化，计数，取不同处理组细胞2.0*103个，分别接种到成胶的millicell内，将millicell小室置于24孔板内，用含10%PBS的RPMI1640培养液中培养48h后，取millicell去除matrigel，少量PBS洗3次，95%乙醇固定15min，HE染色，揭下millicell膜反贴在载玻片上。结果判定：在200倍光镜下，每个滤膜分别计数5个视野的穿膜细胞数，并计算视野的平均穿膜细胞数。

9 统计学方法：所有数据均采用均数±标准差表示，两组间均数采用t检验。应用SPSS12.0统计学软件分析。

结果

1 与癌周肝组织比较肝细胞癌中T cadherin的表达显著下降免疫组化研究显示，T cadherin表达位于细胞膜呈棕黄色，T cadherin在肝细胞癌中的表达评分显著的低于癌旁肝组织，分别为2.04±0.18和3.26±0.15,两者差异有显著性意义(P＜0.01).RT-PCR和Western Blot检测结果进一步证实,肝细胞癌中T cadherin的mRNA和蛋白质的表达水平显著低于癌旁肝组织(P＜0.01).

2 T cadherin的表达下调与肝细胞癌的恶性分化程度无相关性对20例低分化肝细胞癌和10例中、高分化的肝细胞癌患者的组织进行免疫组化研究表明, T cadherin在低分化肝细胞癌中和中、高分化肝细胞癌中的表达评分分别为2.15±0.16和1.89±0.18, 两者差异无统计学意义(P＞0.05).

3 T cadherin的表达下调与肝细胞癌的肝内转移特征相关对20例合并门静脉分支癌栓和10例不合并癌栓的肝细胞癌患者的肿瘤组织进行免疫组化学研究表明，T cadherin在合并门静脉癌栓的肝细胞癌组织中阳性表达评分显著低于不合并门静脉癌栓的肝细胞癌，其表达评分分别为0.93±0.17和1.97±0.18，两者差异有显著性意义(P＜0.05).

4 T cadherin的表达水平与肝细胞癌细胞增殖速度和侵袭能力呈负相关为进一步明确T cadherin的表达水平对肝细胞癌细胞增殖的影响，对MHCC97L细胞通过RNAi进行T-cadherin沉默后，结果表明，T cadherin表达沉默后的癌细胞的生长速度和侵袭能力均明显快于未沉默的癌细胞(P＜0.05)。且细胞T cadherin表达水平越低，细胞的增殖速度越快，侵袭能力越强，显示T cadherin表达水平与癌细胞的增殖速度和侵袭能力呈负相关。

讨论

粘附分子Cadherin超家族为细胞表面糖蛋白，参与包括调节钙介导的细胞粘附，细胞极性及形态形成，细胞的聚集和迁移，细胞的识别和信号转导机制。T-Cadherin即T-钙粘蛋白，属细胞粘附分子Cadherin超家族，亦称H-钙粘蛋白或钙粘蛋白13或CDH13［10,11］。T-Cadherin在许多正常组织中广泛表达，其主要生物功能为介导同种细胞间的粘附和迁移。近年来，业已发现T-Cadherin在多种人类恶性肿瘤，如肝癌，肺癌，胃癌，结直肠癌等中表达均有不同程度的减少。

原发性恶性肿瘤转移发生的首要条件就是肿瘤细胞能以原发灶脱落，而这一生物学特征与Cadherin的功能有密切关系，肿瘤细胞之间通过Cadherin作用而发生粘附，不易脱落，当Cadherin表达下降时，肿瘤细胞间的粘附力减弱，从而易引起肿瘤的转移。近年已相继有T-Cadherin分子在肝癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌及胃癌表达显著下降、缺失的报道［10,12］，因此可以推测T-Cadherin分子在肿瘤的发生、发展的过程中可能扮演肿瘤抑制基因角色。

本实验对手术切除的人肝癌组织及3株不同侵袭潜能的肝癌细胞系运用免疫组织化学和RT-PCR及Western blot方法检测其T-Cadherin表达，结果表明，T-Cadherin在肝癌组织中低表达，其表达强度与肿瘤侵袭呈负相关, 表明T cadherin的表达下调可能参与了肝细胞癌的恶性转化。研究还发现，T cadherin在合并门静脉癌栓的肝细胞癌组织中阳性表达评分显著低于不合并门静脉癌栓的肝细胞癌，表明T cadherin的表达下调与肝细胞癌的肝内转移特征密切相关。这一结果与国内外多项类似研究相似，多认为在高侵袭性肿瘤中，T-Cadherin低表达，且转移灶表达低于原发灶，其表达与肿瘤分化无关，与肿瘤转移潜能负相关［5,7］。

同时我们应用基因沉默技术抑制了MHCC97L细胞的T-Cadherin表达水平，结果肝癌细胞体外增殖和侵袭能力明显增加，这表明T-Cadherin在肝癌粘附、侵袭过程中起重要作用，其具体机制还有待进一步研究。

参考文献

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作者单位 215000 苏州市立医院北区肿瘤科1

215000 苏州市立医院北区消化科2(通讯作者)

215000 苏州大学细胞生物学系3