2个中亚杏品种自交不亲和SFB基因的克隆及序列分析
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摘 要：【目的】为了获得杏中亚生态品种群中自交不亲和花粉特异表达的SFB基因全长，探讨SFB基因序列多态性，【方法】以中亚生态品种群‘馒头玉吕克’和‘索格佳娜丽’2个杏品种为材料，利用RT-PCR及RACE技术和DNAMAN软件分析，克隆得到了2个新的SFB基因的全长cDNA，SFB33（HQ148064）和SFB50（HQ148074）。【结果】SFB33全长1 378 bp，SFB50全长1 313 bp，两个基因开放阅读框均为1 131 bp，编码376个氨基酸；与GenBank上已登录的SFB基因核苷酸序列进行Blast比对，SFB33基因与SFB-c（FJ362527）同源性为79%；SFB50基因与SFB23（EU652886）同源性为99%。在两个基因上均找到F-box区域和两个变异区及两个高变区。李亚科SFB氨基酸序列同源性比对显示SFB50与李亚科其他SFB基因亲缘关系较近，而SFB33与李亚科其他SFB基因亲缘关系较远。【结论】杏中亚生态品种群中SFB基因显示明显的序列多态性。
中图分类号：S662.2 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪04-0551-07
新疆是世界杏重要的起源中心之一，现有杏属（Armeniaca Mill.）植物品种资源200多个类型，种质资源极为丰富[1]。新疆杏属于中亚生态品种群，多数自交不亲和、产量低而不稳[1-2]，使新疆杏生产中授粉成本高且费时费力，因此自交亲和品种的选育工作具有重要意义。
杏自交不亲和的机制与蔷薇科植物其他果树一样，属于S-RNase体系的配子体自交不亲和系统，受一个具有复等位基因的S-基因位点控制，S-基因位点至少包括两个基因，一个是雌蕊基因，决定雌蕊的SI反应，在花柱异表达，其编码产物为S糖蛋白，具有RNase的活性，因而称为S-RNase，它能分解来自相同基因的花粉RNA（rRNA和mRNA），从而抑制离体花粉管生长[3-4]；另一个是花粉S-基因，花粉S基因蛋白产物是一种F-box蛋白，因而称为SFB（S-haplotype-specific F-box protein）[5-7]或SLF[8]。S-基因位点又被称为S-单元型（S-haplotype），同一S-单元型的雌雄S-基因产物相互识别后，将导致自交不亲和反应[9]。花柱S-RNase基因，已在许多植物上已经被成功克隆[4]。花粉S-决定子S-F-box基因的研究相对于花柱S-RNase来说相对较少，目前已经在扁桃[10]、梅[8]、樱桃[6]、欧洲杏[11]、酸樱桃[12]和中国杏[13]等物种中克隆到了此基因。Ushijima等[14]认为SFB 基因具有F-box基区域，含有两个变异区及两个高变区，其中一个变异区及两个高变区均位于3’端，高变区的存在和S- RNase相似，是自交不亲和的作用位点，通过突变的方式改变此区域的序列，可以降低SFB与S-RNase的识别能力。张晓明等[15]发现的3’末端变异区决定了SFB基因的多态性。如在甜樱桃上4个亲和突变品种中3个都是由于花粉部分突变产生的，“JI2434”品种是由于X-射线导致S3’的SFB基因完全缺失，花柱S-RNase基因没有发生改变[16]；“JI4240”是S4’与S4相比，发现在2个高变区上游缺失了4个碱基，导致移码突变，正是因为缺失，使翻译提前终止，氨基酸序列不含2个高变区，发生S4’的SFB突变[16-17]；意大利亲和甜樱桃品种“Kronio”上发现是由于S5’的终止密码子提前，使得SFB编码区被短截了[18]。Sf是日本杏（P. mume）中的自交亲和基因，研究发现其自交亲和的原因是因为PmSFB在中部存在1个6.8 kb的插入片段，致使C末端的翻译提前终止，氨基酸序列也缺乏两个高变区[17]。对这些亲和品种亲和突变原因的认识有助于我们更好的了解果树GSI的机理。本研究组前期开展了南疆杏品种自交不亲和S-RNase基因型的鉴定[19]以及SFB基因的克隆及实时定量表达[20]，旨在通过了解南疆杏自交不亲和基因的序列结构特点，为今后通过RNA干扰技术诱使自交不亲和基因在识别反应中沉默，从而改良自交不亲和品种。我们
以2个完全自交不亲和中亚杏品种花粉为试材，通过RT-PCR和RACE获得了2个SFB基因的全长，为从分子水平上解析新疆杏自交不亲和花粉SFB基因，改良自交不亲和杏品种提供理论基础。
1 材料和方法
1.1 材料
本试验于2010年3月下旬至4月初于新疆农业科学院轮台国家果树资源圃采集‘馒头玉吕克’和‘索格佳娜丽’品种成龄杏树气球期的花蕾，带回室内，用镊子剥取花药，置于阴凉干燥处晾干，收集于1.5 mL离心管中，添加变色硅胶颗粒后置于-70 ℃低温保存。
1.2 总RNA的提取及RT-PCR
1.3 基因全长的克隆
所有的样品至少5个测序重复，测序均在华大基因（北京）完成，将测序结果用DNAMAN（版本6.0.3.99）软件进行分析，分析校对后的核苷酸序列在GenBank中Blast，将本实验克隆所得到的基因与已经登录的李亚科其他SFB基因推导的氨基酸序列进行结构分析，并用DNAMAN软件多序列比对，参数为默认值，构建种系同源树。
2 结果与分析
2.1 杏SFB基因全长的克隆及序列分析
2.2 蔷薇科杏属花粉SFB基因氨基酸序列比较和结构分析
2.3 蔷薇科李亚科花粉SFB基因同源性及系统进化分析
3 讨 论
本研究利用RT-PCR和RACE技术从两个南疆杏品种中获得了两个全长的SFB基因，并利用生物信息学的方法对SFB基因进行了分析。克隆得到的中国杏花粉SFB基因具有F-box基因的基本结构，含有两个变异区及两个高变区，SFB差异的碱基分散在整个序列中，其中一个变异区及两个高变区（V2、HVa和HVb）均位于3'端，这与郭长奎等[22]在扁桃中克隆得到的花粉全长SFB基因的结构相似。Ushijima等[17]认为SFB高变区的存在和S- RNase相似，是自交不亲和的作用位点，通过突变的方式改变此区域的序列，降低SFB与S-RNase的识别能力。本研究得到的花粉SFB基因在3'端有两个高变区，其中HVa区比HVb显示更明显的多态性，通过干扰高变区表达，影响花粉S基因的识别专一性，从而产生自交亲和突变，可以作为研究自交亲和突变机制的突破口，也可以为今后通过遗传转化培育自交亲和果树品种提供研究策略。
张钊等[2]按照杏的起源、生态、生物学特性等方面的研究，认为‘索格佳娜丽’属于中亚细亚生态品种群，是一个最古老而变异最多的类群；‘馒头玉吕克’属于欧洲生态品种群，起源历史较短，约有2000多年。‘馒头玉吕克’与‘索格佳娜丽’表现出的遗传差异是起源演化上的差异，还是不同生态群的差异表现，尚需要克隆更多属于这两个生态群的不同品种的SFB基因进行验证；同时，SFB33所表现出的这种同源差异，要想明确它和其他SFB基因之间的关系，也需要分离鉴定更多的相关基因来验证，可为进一步深入研究新疆杏S基因型的演化关系提供宝贵的材料。
4 结 论
本实验成功克隆新疆两个杏品种‘馒头玉吕克’和‘索格佳娜丽’SFB基因全长：SFB33和SFB50，SFB33全长1 378 bp，SFB50全长1 313 bp，两个基因开放阅读框均为1 131 bp，编码376个氨基酸。基因序列比对显示与蔷薇科其他植物SFB基因同源率最高达到77%和99%，亲缘关系比显示SFB50与李亚科其他SFB基因亲缘关系较近，SFB33与李亚科其他SFB基因亲缘关系较远。
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