HPLC―ELSD测定乌贝益胃胶囊中贝母素甲和贝母素乙含量

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摘要：目的 建立高效液相色谱-蒸发光散射检测器法（hplc-elsd）同时测定乌贝益胃胶囊中贝母素甲和贝母素乙含量的方法，并对10批样品进行考察，制定含量限度。方法 采用HPLC-ELSD，色谱柱为Eclipse XDB C18（150 mm×4.6 mm，5 ?m），流动相为乙腈-水-二乙胺（65∶35∶0.05），柱温为30 ℃，流速为1.0 mL/min。ELSD参数：漂移管温度为80 ℃，载气流速为2.5 L/min。结果 贝母素甲和贝母素乙进样量分别在0.294～2.944 ?g、0.424～4.240 ?g范围内与各自峰面积的对数值呈线性关系，平均加样回收率分别为98.13%（RSD=1.02%，n=6）、98.38%（RSD=0.92%，n=6）。结论 本方法准确可靠，重复性好，为乌贝益胃胶囊质量标准的制定提供了依据。

关键词：高效液相色谱-蒸发光散射检测器；乌贝益胃胶囊；贝母素甲；贝母素乙；含量测定

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.03.022

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）03-0057-03

乌贝益胃胶囊是本院在乌贝散的基础上创制而成的医院制剂，由海螵蛸、浙贝母、白及、酒大黄、黄连、三七、吴茱萸7味中药组成，具有抑酸止痛、养胃止血的功效，临床上主要用于胃酸过多、胃及十二指肠溃疡伴出血、糜烂性胃炎以及各种原因所致的胃出血等症。浙贝母作为君药，其主要活性成分贝母素甲和贝母素乙具有镇痛抗炎、促进溃疡愈合的作用[1-2]，与乌贝益胃胶囊的主要药理作用相吻合，所以，有必要对其中的主要生物碱贝母素甲和贝母素乙进行含量控制，从而控制药品质量，保证疗效。由于贝母素甲和贝母素乙为异甾体生物碱，缺少发色团，用紫外吸收检测器无法检测到，所以，一般采用薄层扫描法[3]、柱前衍生化法[4]、气相色谱法[5]。也有文献报道采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器法（HPLC-ELSD）测定贝母素甲和贝母素乙的含量[6-7]。为确保产品质量，本试验采用HPLC-ELSD测定乌贝益胃胶囊中这两种生物碱的含量。现报道如下。

1 仪器与试药

Agilent1100型HPLC仪，包括G1311A四元泵、G1316A柱温箱（美国Agilent公司）；UM3000蒸发光散射检测器（上海通微分析仪器有限公司）；Metler-D2025型十万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；AS3120A型超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。

贝母素甲对照品（批号110750-200608）、贝母素乙对照品（批号110751-200709）均由中国药品生物制品检定所提供；乙腈、甲醇（色谱纯，山东禹王实业有限责任公司）；水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。乌贝益胃胶囊10批（本院自制）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Eclipse XDB C18（150 mm×4.6 mm，5 ?m）；流动相：乙腈-水-二乙胺（65∶35∶0.05）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃。ELSD参数：漂移管温度为80 ℃，载气流速为2.5 L/min。在此条件下，样品中的其他物质对含量测定无干扰。色谱图见图1。

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取贝母素甲对照品3.68 mg、贝母素乙对照品5.30 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1 mL含147.2 ?g贝母素甲、212.0 ?g贝母素乙的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取本品内容物约10 g，置具塞锥形瓶中，加氨水15 mL浸润30 min，再加氯仿超声处理2次（频率40 kHz，功率250 W），每次50 mL，时间30 min，滤过，用氯仿10 mL洗涤药渣，合并氯仿液，回收氯仿至干，残渣加pH为1的盐酸水溶液20 mL溶解并转移至分液漏斗中，残渣再加氯仿20 mL溶解并转移至同一分液漏斗中，分取水层，氯仿层再用pH为1的盐酸水溶液提取2次，每次20 mL，弃去氯仿层，合并3次水提液，加氨水至pH 11，再用氯仿提取4次，每次20 mL，合并氯仿层，回收氯仿至干，残渣用甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45 ?m）滤过，即得。

2.4 阴性对照溶液的制备

按处方制备工艺制成缺浙贝母的阴性样品，按“2.3”项下方法制备阴性对照溶液。

2.5 线性关系考察

精密吸取上述对照品溶液2.0、5.0、10.0、15.0、20.0 ?L，按上述色谱条件分别进样，测定峰面积。以贝母素甲和贝母素乙对照品的进样量（?g）的常用对数值为横坐标，以峰面积的常用对数值为纵坐标，进行线性回归。结果回归方程分别为：贝母素甲Y=1.112 3X+4.953 1（r=0.999 8）；贝母素乙Y=1.081 9X+5.134 6（r=0.999 9）。贝母素甲和贝母素乙的线性范围分别为0.294～2.944 ?g、0.424～4.240 ?g。

2.6 精密度试验

取“2.3”项下供试品溶液，按上述色谱条件，连续进样5次，测定峰面积，计算RSD。结果贝母素甲、贝母素乙的RSD分别为0.75%、0.68%，表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验

取同一批样品（批号20110502）6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，以含量为指标计算RSD，考察方法的重复性。结果贝母素甲、贝母素乙含量的平均值（n=6）分别为61.9、26.3 ?g/粒，RSD分别为0.92%、0.87%，表明本方法重复性良好。

2.8 稳定性试验

取“2.3”项下供试品溶液，室温放置，分别于1、3、5、7、10 h在上述色谱条件下进样20 ?L，测定峰面积，计算RSD。结果贝母素甲和贝母素乙的RSD分别为0.81%、0.95%，表明供试品溶液在10 h内稳定性良好。

2.9 加样回收率试验

取已知含量的同一批样品（批号20110502）适量，共6份，每份各加入一定量的对照品溶液，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，测定并计算加样回收率，结果见表1。

2.10 样品含量测定

取10批样品，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液。分别取对照品溶液10、20 ?L，供试品溶液10 ?L，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，用外标两点法对数方程分别计算供试品中贝母素甲和贝母素乙的含量。结果见表2。

3 讨论

贝母素甲在紫外光区无吸收，贝母素乙在紫外光区204 nm有末端吸收，采用高效液相色谱-紫外检测法进行检测时，受流动相影响较大，检测灵敏度低，采用蒸发光检测器检测，效果理想。

确定流动相时，参考有关文献[1，6-7]，尝试过乙腈-水-二乙胺的不同配比混合，均未能将杂峰与贝母素甲和贝母素乙有效分离，故只能在供试品溶液的制备中采用酸碱处理进一步纯化，以除去杂质的干扰。

比较了氯仿与乙醚提取，结果表明氯仿的提取率高；比较了回流、超声、冷浸的方法，结果回流方法提取率较低，冷浸方法提取率稍高，但以超声提取方法较简单、快速，且提取较完全。

本试验测定结果表明，10批乌贝益胃胶囊中的贝母素甲和贝母素乙含量差异较大，这可能与原料的质量和生产工艺有关。根据单味药浙贝母的含量限度，结合本制剂中浙贝母所加量和制剂工艺，建议本品贝母素甲和贝母素乙总量的限度为：本品每粒含浙贝母以贝母素甲和贝母素乙总量计，不得少于70.0 ?g。

本试验建立的含量测定方法专属性强，经氯仿提取后可排除其他非测定物质的干扰，测定结果准确可靠，相关性好，可作为乌贝益胃胶囊的质量控制方法。

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：274.

[2] 张明发，沈雅琴.浙贝母药理研究进展[J].上海医药，2007，28（10）：459.

[3] 甄汉深，张三平，高岚.薄层扫描法测定乌贝散中贝母素甲、贝母素乙的含量[J].中成药，1997，19（11）：13.

[4] Ding K， Lin G， Hu YP， et al. Prederivatization and high- performance liquid chromatographic analysis of alkaloids of bulbs of Fritillaria[J]. J Pharm Sci，1996，85（11）：1174.

[5] 闫明，仲婕，刘庆华，等.十种贝母裂解气相色谱分析鉴定[J].现代应用药学，1996，l3（5）：19.

[6] 马双成，张树潘，鲁静，等.高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定鹤蟾片中贝母素甲和贝母素乙的含量[J].药物分析杂志，2008，28（1）：118.

[7] 张东杰，张爱武，王丽杰.HPLC-ELSD法测定平贝母中贝母素甲、贝母素乙含量[J].中国食品学报，2009，9（2）：194.

（收稿日期：2012-07-10，编辑：陈静）