三清安眠汤剂的镇静催眠作用及作用机制探讨
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要：目的:考察三清安眠汤剂是否具有镇静催眠作用，及其可能的五羟色胺能机制。方法：连续灌胃给药14天后测定对正常小鼠和给与咖啡因导致中枢兴奋小鼠自主活动的影响，测定对正常小鼠与阈上戊巴比妥钠催眠作用的协同作用；连续灌胃给药21天后测定对正常小鼠与阈下戊巴比妥钠催眠作用的协同作用；连续灌胃给药14天后，用HPLC-电化学检测器测定对正常大鼠海马5-HT含量的影响。结果：三清安眠汤剂显著减少正常小鼠和咖啡因导致中枢兴奋小鼠的自主活动；与阈上和阈下剂量的戊巴比妥钠有显著性的协同作用；显著升高正常大鼠海马5-HT的含量。结论：在本实验条件下，三清安眠汤剂对实验动物具有显著的镇静催眠作用其作用机制可能与升高海马5-HT的含量有关。
关键词：中医；中药；催眠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-7717（2011）04-0848-04
To Explore the Sedation and Hypnosis Effect and the Mechanism of Sanping Sleeping Decoction
XU Yin-ping【sup】1【/sup】，MA Ying【sup】1【/sup】，LIANG Kai-dong【sup】2【/sup】
（1.Affiliated Hospital of Liaoning University of TCM,Shenyang 110032,Liaoning,China
2.Shenyang Armed Police Hospital,Shnyang 110034,Liaoning,China）
Abstract:Objective:To examine whether the sanqing sleeping decoction have the function of sedation and hypnosis and the possible mechanism of 5-Hydroxytryptamine.methods:To determine the effects of spontaneous motion in normal mice and in the mice excited by caffeine and to determine the synergistic effect of the syngignoscism of the normal mice and the mice of suprathresholds pentobarbital sodium after continous feeding decoction for 14 days.To determine the synergy of the syngignoscism of the normal mice and the mice of the liminal pentobarbital sodiuml. after continuously feeding decoction for 21days .To determine the 5 - HT content of the normal mice by HPLC electrochemical detector after continuously feeding decoction for14days.Results: the sanqing sleeping decoction significantly reduce spontaneous motion of the normal mice and the mice excited by caffeine, And having the significant synergistic effect to suprathresholds pentobarbital sodium and the liminal pentobarbital sodiuml.significantly increased 5 - HT content of the normal mice。Conclusion: Sanqing sleeping decoction had the significant effects of sedation and hypnosis to the experimental mice under this experimental conditions.And the mechanism may related to increase the content of 5 - HT.
Key words:Chinese medicineChinese herbhypnosis
收稿日期：2010-11-11
基金项目：沈阳市科学技术计划项目（061034）
作者简介：徐锦平（1972-）,女,辽宁凌海人,硕士,研究方向:针灸中药治疗神经系统疾病。
三清安眠汤是我院神经内科主任医师马英多年临床实践总结出来的中药方剂，该汤剂由连翘、珍珠母、胆星等组成，具有清心火、清肝火、清痰火的功效。本文通过动物实验对三清安眠汤剂的镇静催眠作用及作用机制进行探讨。
1 实验目的
考察受试药品不同剂量对小鼠自主活动的影响，是否有镇静催眠作用，及其可能的5-HT机制。
2 实验材料
2.1 动物
昆明种小白鼠，体重18～22g，雌雄各半。由沈阳药科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（辽）2003-008。实验前于室温下适应性饲养2天，自由摄食饮水，自然昼夜节律光照。
Wistar大鼠，雄性，8～10周龄，280～320 g，由沈阳药科大学实验动物中心提供。合格证号码SCXK（辽）2003-008，在自由摄食、饮水环境中适应1～2天用于实验。
2.2 药品与试剂
三清安眠汤剂：由辽宁中医药大学附属医院提供。临用前配置成：1/3倍临床等效量（5 g/kg,SQ【sub】1/3【/sub】）、1倍临床等效量（15 g/kg，SQ【sub】1【/sub】）和3倍倍临床等效量（45g/kg,SQ【sub】3【/sub】）。戊巴比妥钠（pentobarbital sodium）：Solarbio, Gemany 69020183。安定（diazepam，阳性对照药）：东北制药总厂，国药准字:H21022887。苯甲酸咖啡因（Caffeinesodium benzoate）：沈阳医药公司。5-羟色胺硫酸肌酐（Serotonin creatinine sulfate complex，5-HT）：sigma，Switzerland，Lot 11K1527。柠檬酸：天津市博迪化工有限公司，分析纯，2007413B。无水乙酸钠：天津市博迪化工有限公司，分析纯，20070509。EDTANa2：天津市博迪化工有限公司，分析纯，20071008。辛烷磺酸钠：山东省中美美奥特色谱产品有限公司，20051227。高氯酸：天津市东方化工厂，分析纯，050803。甲醇：山东禹王实业有限公司禹城化工厂，色谱纯，20070904。
2.3 仪器
ZL-2型程控自主活动仪：中国医学科学院协和药物研究所生产。
AL104-IC电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司
L-ECD-6A电化学检测器：SHIMADZΜ, Japan.
ODS-C18色谱柱 （5μ,C【sub】18 【/sub】,200×4.6mm）：Diamonsil【sup】TM【/sup】（钻石），迪马公司
DY89-I型电动玻璃匀浆机：宁波新芝科器研究所
CDMC-4A色谱数据处理仪：上海计算技术研究所
7125高压六通进样阀：RHEODYNE,Μ.S.A.
3 方 法
3.1 最大耐受试验【sup】［1,2］【/sup】
取小鼠20只，将小鼠随机分为空白组和给药组，每组10只，雌雄各半。于实验前12h禁食不禁水，给药组灌胃给予225g/kg的三清安眠汤剂（相当于17倍临床等效量，是浓缩所能达到的最大浓度），给药容量为0.4mL/10g（小鼠最大给药体积），空白组同法给予蒸馏水。在（20±2）℃，相对湿度50%～70%的条件下饲养7天，记录小鼠毒性反应及死亡数。
3.2 对自主活动的影响
3.2.1 对正常小鼠自主活动的影响【sup】［2,3］【/sup】 取小鼠60只，测其10min内的自主活动数，根据该值将小鼠分为空白组、安定组和3个给药组即SQ【sub】1/3【/sub】组、SQ【sub】1【/sub】组、SQ【sub】3【/sub】组，保证每组自主活动初始均值没有统计学差异。每组8～12只不等，雌雄各半。SQ【sub】1/3【/sub】、SQ【sub】1【/sub】、SQ【sub】3【/sub】组分别给予5、15、45g/kg的三清安眠汤剂，空白组和安定组给予蒸馏水，按0.2mL/10g体重灌胃给药两周。末次给药时，安定组灌胃给予0.004g/kg安定，末次给药35min后，放入小鼠自主活动仪中适应10min后，测试10min小鼠的自主活动值。
3.2.2 对给予苯甲酸咖啡因致中枢兴奋小鼠自主活动的影响【sup】［4,5］【/sup】 取小鼠60只，分为空白对照组、模型组、各给药组，每组8-12只不等，雌雄各半。SQ【sub】1/3【/sub】、SQ【sub】1【/sub】、SQ【sub】3【/sub】组分别给予5、15、45g/kg的三清安眠汤剂，空白组和模型组给予蒸馏水，按0.2mL/10g体重灌胃给药两周，末次给药前两天适应ZIL-2型程控自主活动仪，每天同一时段，每天一次，适应两天，每次15min。末次给药35min后，放入小鼠自主活动仪中适应仪器10min，之后模型组、各给药组按0.1mL/10g苯甲酸咖啡因（10mg/kg）【sup】［6-7］【/sup】，再放入自主活动仪测试10min。
3.3 三清安眠汤剂与戊巴比妥钠的协同作用
3.3.1 三清安眠汤剂对阈下剂量戊巴比妥钠致小鼠入睡只数的影响【sup】［1,2］【/sup】 取小鼠60只，分为空白组、安定组和3个给药组即SQ【sub】1/3【/sub】组、SQ【sub】1【/sub】组、SQ【sub】3【/sub】组，每组12只，雌雄各半。SQ【sub】1/3【/sub】、SQ【sub】1【/sub】、SQ【sub】3【/sub】组分别给予5、15、45 g/kg的三清安眠汤剂，空白组和安定组给予蒸馏水，按0.2mL/10g体重灌胃给药3周。末次给药时，安定组灌胃给予0.004g/kg安定，45min后，各组腹腔注射浓度为35mg/kg的戊巴比妥钠（阈下剂量）,记录小鼠入睡的个数。翻正反射消失达1min以上者即为入睡。
3.3.2 三清安眠汤剂对阈上戊巴比妥钠致小鼠睡眠时间的影响【sup】［1,2］【/sup】 取小鼠60只，分为空白组、安定组和3个给药组即SQ【sub】1/3【/sub】组、SQ【sub】1【/sub】组、SQ【sub】3【/sub】组，每组12-16只不等，雌雄各半。SQ【sub】1/3【/sub】、SQ【sub】1【/sub】、SQ【sub】3【/sub】组分别给予5、15、45g/kg的三清安眠汤剂，空白组和安定组给予蒸馏水，按0.2mL/10g体重灌胃给药两周。末次给药时，安定组灌胃给予0.004g/kg安定，45min后，各组腹腔注射浓度为50 mg/kg的戊巴比妥钠（阈上剂量）,记录小鼠睡眠持续时间。
3.4 三清安眠汤剂对大鼠海马5-HT含量的影响
3.4.1 动物的处理及样品的制备 取大鼠24只，随机分为空白组、SQ【sub】1【/sub】组、SQ【sub】3【/sub】组，每组8只。SQ【sub】1【/sub】组、SQ【sub】3【/sub】组分别给予11.7、35 g/kg的三清安眠汤剂，空白组给予蒸馏水，按0.2 ml/10g体重灌胃给药2周。
实验大鼠末次给药45min后，快速断头取脑，冰盘上分离出海马，称重，加入冰冷的0.4mmol/L高氯酸溶液250（l，匀浆，高速离心（4℃，12000rpm,20min），取上清液20（l进样，用HPLC-ECD系统测定5-HT的含量。
3.4.2 5-HT测定的色谱条件 色谱柱：Diamonsil【sup】TM【/sup】,ODS-C18,5μ,C【sub】18 【/sub】；日本岛津10A液相恒流泵，流速1.0mL/min；SHIMADZΜ L-ECD-6A电化学检测器，电化学检测器工作电压:+0.70v检测灵敏度：4nA；柱温：25℃；进样量：25μL；CDMC-4A色谱数据处理仪；流动相：100mmol/L乙酸钠，85mmol/L柠檬酸缓冲液，0.2mmol/LEDTANa【sub】2【/sub】，10%甲醇，0.7mmol/L辛烷磺酸钠色谱图分析与定量：本实验采用峰面积定量。定量法为外标法。
3.4.3 5-HT标准曲线的制定 配制5种不同浓度的5-HT标准品溶液，浓度分别为：0.025、0.05、0.2、0.5、1（g/mL，取20μL进样。以峰面积（A）为纵坐标，5-HT标准品溶液的浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线。
3.4.4 样品中5-HT含量的计算 每克海马中5-HT的含量（μg/g）为：M0.25mL×C／ww为海马的湿重（g）；
C为5-HT样品溶液的浓度，其值由标准曲线方程得出。
3.5 统计方法
三清安眠汤剂对阈下剂量戊巴比妥钠致小鼠入睡只数的影响实验中，实验数据以小鼠入睡的个数表示，采用卡方检验进行统计学处理。其余实验数据以mean± S.E.M表示，采用SPSS 13.0统计软件处理，One-Way ANOVA结合Dunnett’s t-test检验。P
4 结 果
4.1 最大耐受试验
小鼠灌胃给予225g/kg的三清安眠汤剂，相当于17倍临床等效量，后观察1周，空白组和给药组在行为学上无明显区别，且各组无一死亡。
4.2 对自主活动的影响
4.2.1 对正常小鼠自主活动的影响 三清安眠汤剂灌胃给药两周，末次给药45min后，各组小鼠10min内自主活动数测定结果见表1。由表 1可见，三清安眠汤剂组与空白组比较，1/3倍临床等效量对小鼠的自主活动没有显著影响，1倍、3倍临床等效量能显著减少小鼠的自主活动数（P
表1 三清安眠汤剂给药两周后对正常小鼠
自主活动数的影响（mean±S.E.M）
注：与空白组比较，*P
4.2.2 对给予苯甲酸咖啡因致中枢兴奋小鼠自主活动的影响 三清安眠汤剂灌胃给药两周，末次给药后45min后，各组小鼠10min内自主活动数测定结果见表2。由表2可见，三清安眠汤剂组与模型组比较，1/3倍临床等效量对小鼠的自主活动没有显著影响，1倍、3倍临床等效量能显著减少苯甲酸咖啡因致中枢兴奋小鼠的自主活动（P
表2 三清安眠汤剂给药两周后对苯甲酸咖啡因
导致的小鼠自主活动增加的影响
注：与空白组比较，**P
4.3 三清安眠汤剂与戊巴比妥钠的协同作用
4.3.1 三清安眠汤剂与阈下剂量戊巴比妥钠致小鼠入睡只数的影响 三清安眠汤剂连续给药三周后对给予阈下剂量戊巴比妥钠小鼠的入睡只数的影响见表3。由表3可见，三清安眠汤剂组与空白组比较，1/3倍临床等效量对小鼠的睡眠只数没有显著影响，1倍、3倍临床等效量能显著增加阈下剂量戊巴比妥钠小鼠入睡的只数（P
表3 三清安眠汤剂给药三周后对阈下剂量
戊巴比妥钠小鼠催眠作用的影响
注：与空白组比较，*P
4.3.2 三清安眠汤剂与阈上戊巴比妥钠致小鼠睡眠时间的影响 三清安眠汤剂连续给药两周后对给予阈上剂量戊巴比妥钠小鼠的睡眠持续时间的影响见表4。由表4可见，三清安眠汤剂组与空白组比较，1/3倍临床等效量对小鼠的睡眠持续时间没有显著影响，1倍、3倍临床等效量能显著增延长阈上剂量戊巴比妥钠小鼠睡眠持续时间（P
表4 三清安眠汤剂给药两周后对阈上剂量
戊巴比妥钠小鼠睡眠持续时间的影响
注：与空白组比较，*P
4.4 三清安眠汤剂对大鼠海马5-HT含量的影响
4.4.1 应用HPLC-电化学检测5-HT的线性关系 结果如Fig. 1所示，在HPLC结合电化学检测的色谱条件下，5-HT标准品含量在0.025、0.05、0.2、0.5、1（g/mL之间线性关系良好。以峰面积（A）为纵坐标，5-HT标准品溶液的浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线。
4.4.2 5-HT标准品及样品的色谱图 在应用HPLC结合电化学检测的色谱条件下，Fig.2A为5-HT标准品色谱图,Fig.2B为5-HT样品色谱图
4.4.3 大鼠海马5-HT含量测定结果 三清安眠汤剂连续给药两周后对大鼠海马5-HT含量的影响见表5。由表 5可见，三清安眠汤剂给药组与空白组比较，1倍和3倍临床等效量能显著增加大鼠海马5-HT含量（P
表5 三清安眠汤剂连续给药两周后各组
每克海马中5-HT的含量
注：与空白组比较，*P
5 讨 论
三清安眠汤剂是一种口服的中药复方制剂，所以在本实验中采取了灌胃的给药方式。在急性毒性中，选择了做最大耐受试验，主要是考虑到受试药三清安眠汤剂是中药复方制剂，采用灌胃的方式给药，要保证药液的黏稠度能顺利通过灌胃器针头，且在保证药效的前提下三清安眠汤剂所能达到的最大浓度为17倍临床等效量。
三清安眠汤剂连续灌胃给药14天后能够显著减少正常小鼠自主活动，提示三清安眠汤剂对正常小鼠有显著的镇静作用。
为研究三清安眠汤剂的镇静催眠作用，本实验选取了考察三清安眠汤剂对给予苯甲酸咖啡因致中枢兴奋小鼠自主活动的影响【sup】［4-5］【/sup】。选定苯甲酸咖啡因剂量是10mg/kg的原因：（1）查阅大量英文文献，据文献将苯甲酸咖啡因剂量定为10、20mg/kg【sup】［6,7］【/sup】。（2）用苯甲酸咖啡因（10、20mg/kg）做预试验，结果两剂量都能显著增加小鼠自主活动，但20mg/kg作用比10mg/kg强，这点与英文文献也相符。并且，实验室以前用苯甲酸咖啡因增加小鼠自主活动的剂量也是10mg/kg。（3）最后选定观察：三清安眠汤剂给药两周后对苯甲酸咖啡因（10mg/kg）导致的小鼠自主活动增加的影响。
三清安眠汤剂临床给药周期最少为两周，故在自主活动和对阈上剂量戊巴比妥钠致小鼠入睡只数的影响中给药周期为两周。在对阈下戊巴比妥钠致小鼠睡眠时间的影响中，给药两周时，没有观察到显著的药效，故延长给药时间到三周，结果发现1倍和3倍临床等效量的三清安眠汤剂能显著增加阈下剂量戊巴比妥钠致小鼠入睡的只数，这提示1倍和3倍临床等效量的三清安眠汤剂具有显著的安眠作用。
1969年jouvet and koella分别提出了5-羟色胺致眠学说【sup】［8］【/sup】，提出5-羟色胺是与睡眠密切相关的中枢神经递质。实验证明,降低脑内5-HT会引起失眠,失眠恢复同脑内5-HT水平的恢复相平衡。说明5-HT在睡眠中起作用。另外,脑内NA下降及5-HT神经元兴奋可产生镇静作用【sup】［9,10］【/sup】。海马中含有许多与睡眠调节相关的神经递质,如5- HT【sup】［11］【/sup】、NE等海马与中缝核、杏仁核、蓝斑、丘脑、下丘脑等调节睡眠的神经结构间有着复杂的神经联系【sup】［12］【/sup】,所以，本实验选取高效液相结合电化学检测器测定给药两周后大鼠海马处5-HT含量的变化。
小鼠实验的结果表明，三清安眠汤剂1倍和3倍临床等效量对正常小鼠和给予咖啡因的中枢兴奋小鼠的的自主活动有显著的抑制作用，且其与阈上、阈下剂量的戊巴比妥钠引起的正常小鼠的催眠有显著的协同作用。所以，在探讨三清安眠汤剂对大鼠海马5-HT含量的影响时，也采用了这两个剂量，结果表明，与空白组相比，三清安眠汤剂1倍和3倍临床等效量给药两周后能够引起大鼠海马5-HT含量的显著升高。
综上推测三清镇静催眠药对海马5-HT的调节作用可能是其产生镇静催眠的机制之一。
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