羽衣甘蓝DH1代株系遗传稳定性分析

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摘要：以羽衣甘蓝（Brassica oleracea var. acephala）两个自交系（F6代）作比较，利用ISSR标记技术检测了羽衣甘蓝3个dh1代株系的遗传稳定性，并对5个群体进行聚类分析。结果表明，3个DH1代株系DN31、DP70、DT2和两个自交系B62、B111利用9条ISSR引物分别扩增出55、51、50、54和51条清晰条带，其中，多态性位点DN31有3个，DP70有2个，DT2没有，B62有19个，B111有15个。羽衣甘蓝DH1代株系内基本不存在遗传差异，基因型是纯合的，两个自交系遗传稳定性相对较差。表明小孢子培养技术在获得纯合体材料上比人工自交的方法高效、快捷，而且获得的纯系基因型更纯、更稳定。

关键词：羽衣甘蓝（Brassica oleracea var. acephala）；DH系；ISSR标记；遗传稳定性；聚类分析

中图分类号：S635.9；S503 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）13-3056-03

利用小孢子培养技术能快速获得育种急需的遗传稳定材料和培育新的种质资源，提高育种效率。小孢子培养所得植株加倍后获得的双单倍体构成的群体称为DH群体，从DH群体中筛选出来的株系叫DH系，DH系在遗传上是完全纯合的，可以直接作为优良亲本用于品种改良[1]。科研工作者采用小孢子培养技术已获得一系列作物的优良品系[2-4]。ISSR分子标记具有DNA样品用量少、操作简单、信息量大、多态性高等优点，且由于引物更长，退火温度更高因而具有更好的可重复性和稳定性[5]，是分析种质遗传多样性和亲缘关系的有效工具。很多研究均成功地利用ISSR标记技术分析植物的遗传变异性和遗传关系[6-8]。

羽衣甘蓝（Brassica oleracea var. acephala）是十字花科（Cruciferae）芸薹属（Brassica）甘蓝种的一个变种，二年生草本植物，观叶为主，由于耐寒性强，观赏期长，已成为我国广大地区冬季及早春时节应用最广泛的观赏植物之一[9]。利用游离小孢子培养技术开展羽衣甘蓝育种工作，能快速获得育种急需的遗传稳定材料，提高育种效率。小孢子植株DH系基因型理论上是完全纯合的，而通过多代自交也可以达到此目的。为了比较小孢子培养技术和人工自交分别获得纯合体材料的效率，试验以羽衣甘蓝两个自交系作比较，利用ISSR标记技术检测了羽衣甘蓝3个基因型DH1代株系的遗传稳定性，并对5个株系进行了聚类分析。

1 材料与方法

1.1 材料

羽衣甘蓝3个基因型名古屋-红、P3、东京-白的DH1代DN31、DP70和DT2，名古屋-红和“K12”的自交系B62（F6代）和B111（F6代），材料来源及主要特征见表1。由羽衣甘蓝小孢子培养获得的植株称为DH0代，经DH0代自交的自交一代称为DH1代。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 分别从供试材料各单株上取幼嫩叶片，参照王灏等[10]的方法，用稍作改良的CTAB小量法提取基因组DNA。

1.2.2 ISSR扩增 ISSR引物自行设计，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系20 μL，其中10×Buffer 2 μL，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq DNA 聚合酶1 U，引物0.5 μmol/L，模板DNA 20 ng。 扩增反应程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，58 ℃复性45 s，72 ℃延伸90 s，接着梯度降温进行复性，5个循环后稳定在53 ℃复性，进行38个循环；最后72 ℃延伸10 min，扩增产物在4 ℃保存。扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶（TAE电泳缓冲液，0.5 μg/L溴化乙锭）电泳检测。在凝胶成像系统上观察、拍照鉴定。

1.2.3 数据分析 ISSR电泳结果采取0/1赋值记带，有带记为1，无带记为0。对原始矩阵用SimQual程序求Jaccard相似系数矩阵，并获得相似系数矩阵。利用PopGene 32软件计算扩增产物的多态性位点数（the number of polymorphic loci，N）、多态性位点比率（the percentage of polymorphic loci，P）、Shannon多样性指数。用NTSYS-pc 2.10e软件进行数据分析，将由“1”和“0”生成的原始矩阵用UPGMA方法进行聚类分析，最后通过Tree plot模块生成聚类图。

2 结果与分析

2.1 羽衣甘蓝DH1代株系ISSR标记扩增产物的多态性

从38个ISSR引物中选取9个能够获得清晰条带、反应稳定的ISSR引物（表2）。DN31、DP70、DT2每个株系各选取8株进行ISSR标记分析，结果表明，这3个DH1代株系9条ISSR引物分别扩增出清晰、稳定性好的条带55、51和50条（图1），大小在200～1 500 bp，其中多态性位点DN31为3个，DP70为2个，DT2没有，每条引物扩增的条带数在3～8条；3种材料的多态性位点比率分别为5.45%、3.92%和0，平均多样性指数（I）分别为0.033 7、0.094 0和0 （表3），其中DT2没有多态性位点，说明它的各株系间完全没有差异；从多态性位点比率和多样性指数上可以看出，羽衣甘蓝3个材料DH1代株系间基本无遗传差异，说明由小孢子培养所得的植株经过自交后的DH1代各株系基因型是纯合的。

同时也对两个经过6代自交的自交系材料（B62、B111）进行了ISSR分析，结果表明，B62和B111的多态性位点比率分别为35.19%和29.41%，平均多样性指数（I）分别为0.183 6和0.167 1（表3）。经过6代自交的材料在遗传上还远远没有达到纯合，说明通过小孢子培养获得纯系相对于人工自交来说，不仅缩短了育种时间，也提高了效率，能在1～2年内就获得遗传稳定的纯系。

2.2 DH1代株系ISSR聚类分析

对羽衣甘蓝3个DH1代株系和2个自交系ISSR结果进行聚类分析，结果见图2。从图2可以看出，DH1代株系DN31、DP70、DT2的各株系间相似系数分别为0.97～1.00、0.98～1.00和1.00，说明这3个株系在遗传上极其相似，表明它们在遗传上是纯合的，DN31、DP70株系内略存在一些变异，这可能是自交过程中出现的稍许变异，在正常变异范围内。而两个自交系B62和B111的相似系数范围则相对大许多，分别为0.82～0.98和0.83～0.94，说明这两个自交系内各单株还存在一定程度的遗传差异，基因型还没有达到纯合。再一次验证了DH1代比F6代自交系纯合度高。

3 小结与讨论

小孢子植株DH1论上其基因型是完全纯合的，即DH1代株系内各单株之间在遗传组成上完全相同，不存在差异。通过ISSR标记分析了羽衣甘蓝3个DH1代株系内的遗传多样性，并以F6代自交系作为对比，结果发现，3个DH1代株系内的遗传多样性都极小，其相似系数均接近于1，其中DH1代株系DT2各单株间完全没有差异，遗传相似系数为1.0；在DH1代株系DN31和DP70中存在较小的差异，可能是由于ISSR分析过程中存在某些误差，或者是种植于大田中受到环境因素的影响发生的稍许变异。总体来讲，羽衣甘蓝的DH1代株系内基本不存在遗传差异，基因型是纯合的。被试的两个自交系的遗传多样性则相对大得多，说明自交6代的自交系其在遗传上远未达到纯合，因此羽衣甘蓝要想通过人工自交的手段获得纯系，自交6代还远不够，估计至少要自交8～10代。这也证实了小孢子培养技术在获得纯合体材料上比人工自交的方法更高效、快捷，而且获得的纯系在基因型上更纯、更稳定。

参考文献：

[1] 顾宏辉，胡林军，周伟军.小孢子培养技术在芸苔属作物育种上的应用研究进展[J].农业生物技术学报，2004，12（2）：219-223.

[2] 吴江生，石淑稳，周永明，等.甘蓝型双低油菜品种华双3号的选育和研究[J].华中农业大学学报，1999，18（1）：1-4.

[3] 耿建峰，原玉香，张晓伟，等.利用游离小孢子培养育成早熟大白菜新品种‘豫新5号’[J].园艺学报，2003，30（2）：249.

[4] DAI X G， SHI X P， FU Q， et al. Improvement of isolated microspore culture of ornamental kale （Brassica oleracea var. acephala）： effects of sucrose concentration， medium replacement， and cold pre-treatment[J]. Journal of Horticultural Science and Biotechnology，2009，84（5）：519-525.

[5] REDDY M P， SARLA N， SIDDIQ E A. Inter simple sequence repeat（ISSR） polymorphism and its application in plant breeding[J]. Euphytica，2002，128（1）：9-17.

[6] 齐迎春，宁国贵，包满珠.应用ISSR分子标记和表型性状评价孔雀草自交系的遗传关系[J].中国农业科学，2007，40（6）：1236-1241.

[7] ZHANG L J， DAI S L. Genetic variation within and among populations of Orychophragmus violaceus （Cruciferae） in China as detected by ISSR analysis[J]. Genetic Resources and Crop Evolution，2010，57（1）：55-64.

[8] TALEBI R， HAGHNAZARI A， TABATABAEI I. Assessment of genetic variation within international collection of Brassica rapa genotypes using inter simple sequence repeat DNA markers[J]. Biharean Biologist，2010，4（2）：145-151.

[9] ZHANG W， FU Q， DAI X G， et al. The culture of isolated microspores of ornamental kale （Brassica oleracea var. acephala） and the importance of genotype to embryo regeneration[J]. Scientia Horticulturae，2008，117（1）：69-72.

[10] 王 灏，王道杰，谭小力，等.用于RAPD分析的油菜总DNA的快速提取[J].西北农业学报，2001，10（3）：32-34.