PI―103对人黑色素瘤A375细胞迁移和侵袭能力的影响及其机制研究
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[摘要] 目的 观察pi-103在体外对人黑色素瘤a375细胞迁移和侵袭能力的影响，并探讨可能的作用机制。 方法 应用MTT法检测不同浓度PI-103对A375细胞增殖的影响，Transwell小室实验检测0.1、0.2 μmol/L PI-103对A375细胞迁移能力和侵袭能力的影响，Western Blot法测定细胞基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9的表达。 结果 0.1、0.2 μmol/L PI-103对A375细胞增殖的抑制作用不明显（P > 0.05）；在浓度高于0.4 μmol/L时，PI-103能够明显抑制A375细胞的增殖（P < 0.05）。0.1 μmol/L PI-103作用后，迁移实验和运动实验穿膜细胞数分别为（91.73±13.80）、（63.67±8.54），与对照组比较明显减少，差异有统计学意义（P < 0.05）；0.2 μmol/L PI-103作用后，迁移实验和运动实验穿膜细胞数分别为（64.07±9.22）、（34.80±7.89），与对照组比较明显减少，差异有统计学意义（P < 0.05）。0.1、0.2 μmol/L PI-103作用后，A375细胞MMP-2、MMP-9蛋白表达明显低于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 PI-103可通过下调MMP-2、MMP-9的表达抑制A375细胞迁移和侵袭，为其应用于抗恶性黑素瘤转移治疗提供了实验依据。
[关键词] PI-103；黑色素瘤；迁移；侵袭
[中图分类号] R739.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）09（a）-0014-04
[Abstract] Objective To investigate the effects of PI-103 on the migratory and invasive abilities of human melanoma A375 cells in vitro and its mechanism. Methods The effects of PI-103 with different concentration on the proliferation of A375 cells were detected by MTT assay. The effects of PI-103 at 0.1， 0.2 μmol/L concentration on the migratory and invasive abilities of A375 cells were detected by transwell chamber assay. The expressions of MMP-2 and MMP-9 in A375 cells were determined by Western Blot. Results The inhibition effects on the proliferation of A375 cells treated with PI-103 at 0.1， 0.2 μmol/L concentration were not significant （P > 0.05）. The proliferation of A375 cells treated with PI-103 at the concentration higher than 0.4 μmol/L was significantly inhibited （P < 0.05）. The numbers of transmembrane cells in the migration and invasion experiment treated with PI-103 at 0.1 μmol/L concentration were （91.73±13.80）， （63.67±8.54） respectively， which were significantly decreased compared with control group （P < 0.05）. The numbers of transmembrane cells in the migration and invasion experiment treated with PI-103 at 0.2 μmol/L concentration were （64.07±9.22）， （34.80±7.89） respectively， which were significantly decreased compared with control group （P < 0.05）. The expressions of MMP-2 and MMP-9 in A375 cells treated with PI-103 at 0.1， 0.2 μmol/L concentration were significantly decreased compared with control group （P < 0.05）. Conclusion PI-103 can inhibit the migration and invasion of A375 cells by down-regulation of the expressions of MMP-2 and MMP-9， which provide the experimental basis for the prevention of melanoma metastasis.
[Key words] PI-103； Melanoma； Migration； Invasion
恶性黑素瘤是一种起源于黑色素细胞的高度恶性肿瘤，易转移是其死亡率高的主要原因。黑色素瘤细胞的侵袭转移与信号转导通路的异常激活密切相关，在有关信号转导通路抑制剂中，筛选出高效、低毒的抗黑色素瘤细胞转移药物已成为其研究重要的发展趋势。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一种非典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，与其上游的磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（PKB，又称Akt）构成了PI3K/Akt/mTOR信号转导通路。笔者前期及既往其他研究结果显示，PI3K/Akt/mTOR信号通路与黑素细胞的增殖和转移密切相关[1-2]。PI-103是PI3K和mTOR的双重抑制剂，已有研究报道，PI-103在较低浓度下就能导致黑色素瘤细胞周期阻滞，从而抑制其增殖并诱导凋亡[3]，但有关PI-103对黑色素瘤细胞迁移和侵袭的影响国内外鲜见报道。本研究旨在观察PI-103在体外对人黑色素瘤A375细胞迁移和侵袭能力的影响，并探讨可能的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
PI-103（纯度99.59%）购自美国MCE公司；人黑色素瘤A375细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所；RPMI1640培养液购自美国Gibco公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）购自美国Sigma公司；胎牛血清（FBS）购自杭州四季青生物工程材料有限公司；Millicell悬挂式Transwell小室（孔径8 μm）购自美国Millipore公司；Matrigel购自美国BD公司；鼠抗人基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinases-2，MMP-2）、MMP-9单抗、碱性磷酸酶标记羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 将A375细胞置于37℃、5%CO2的孵箱中常规培养，培养液为含10%FBS的RPMI1640。每隔48 h换液1次，以1∶3的比例传代。
1.2.2 MTT法检测PI-103对A375细胞增殖的影响 取对数生长期A375细胞，调整细胞密度为1×105/mL，接种于48孔板，200 μL/孔。培养24 h后吸除培养液，每孔分别加入200 μL不同浓度的PI-103（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 μmol/L），每组设5个复孔，同时设空白对照组，对照组加入等量不含PI-103的培养液。24 h后加入20 μL MTT（5 mg/mL），37℃作用4 h后加150 μL DMSO，振荡10 min，酶标仪测490 nm处吸光度（OD）值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=（1-实验组OD/对照组OD）×100%。
1.2.3 Transwell迁移实验检测PI-103对A375细胞迁移力的影响 取对数生长期A375细胞以1×105/mL细胞悬液接种于24孔板，24 h后加入不同浓度的PI-103（终浓度0.1、0.2 μmol/L），设空白对照组，对照组加入等量不含PI-103的培养液，48 h后收集细胞。各组细胞消化、离心后用无血清RPMI1640培养液重悬，调整细胞密度至1×106/mL。将Transwell小室置入24孔板，上室加入200 μL无血清RPMI1640培养液，37℃放置1 h，吸除小室内培养液，上室加入200 μL各组细胞重悬液，下室加500 μL含10%FBS的RPMI1640培养液，37℃、5%CO2孵育24 h后取出小室，棉签擦去滤膜上层细胞，PBS清洗滤膜，4%的多聚甲醛固定15 min，0.1%结晶紫染色15 min。400倍显微镜下随机计数不重叠5个视野的穿膜细胞数，计算平均值。实验重复3次，每组设3个复孔。
1.2.4 Transwell侵袭实验检测PI-103对A375细胞侵袭力的影响 4℃溶解Matrigel过夜，用预冷的无血清培养液以1∶8稀释Matrigel，取50 μL均匀涂于Transwell小室上室的聚碳酸酯膜上，37℃放置30 min，使Matrigel聚合成凝胶，后续同迁移实验。细胞接种密度为2×105/mL。
1.2.5 Western Blot法测定PI-103对A375细胞MMP-2、MMP-9表达的影响 同“1.2.3”项下操作收集细胞，加入细胞裂解液，离心提取蛋白质定量，进行SDS-PAGE电泳分离，电转至PVDF膜上，5%的脱脂奶粉封闭，加入鼠抗人MMP-2、MMP-9单抗作一抗，4℃过夜，TBST洗膜，用碱性磷酸酶标记羊抗鼠IgG作为二抗，37℃孵育2 h，TBST洗膜，加入ECL进行曝光，洗片后用图像分析系统进行吸光度扫描，以GAPDH作为内参，用各蛋白吸光度值/内参吸光度值进行比较。
1.3 统计学方法
采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
3 讨论
PI3K/Akt/mTOR信号通路在多种恶性肿瘤中高度激活，调控肿瘤细胞增殖、生长、转移等过程，已成为肿瘤治疗的一个重要靶点[4]。有研究表明，单纯阻断PI3K/Akt通路，并不能有效抑制下游mTOR通路，因为mTOR信号通路的激活除了来自PI3K/Akt途径，还可来自其他信号通路，而单纯抑制mTOR通路，却可能通过负反馈活化PI3K激酶。所以，同时使用PI3K和mTOR的双重抑制剂更能有效抑制肿瘤的生长和转移[5]。PI-103是人工合成的脂质激酶家族中的一种小分子药物，能同时抑制PI3K和mTOR，尤其是PI3Kα、mTORC1和mTORC2，而且PI-103有良好的药物稳定性，毒副作用小[6-7]。已有研究发现，PI-103可抑制结直肠癌细胞[7]、乳腺癌细胞[8]、神经母细胞瘤细胞[9]、肝星状细胞细胞[10]、肾癌细胞[11]的增殖，还可抑制结直肠癌细胞[12]、神经胶质瘤细胞[13]的转移，同时可增强顺铂[6]、厄洛替尼[14]等化疗药物抗肿瘤效果。
Transwell小室能够较为理想地模拟和反映肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，是检测肿瘤细胞体外迁移力和侵袭力最经典的实验方法。本实验旨在研究PI-103对A375细胞迁移和侵袭的影响，若出现细胞活力下降则影响结果的判断，因此本研究选择了PI-103对A375细胞活力影响小的浓度（低于0.4 μmol/L）来进行Transwell体外迁移和侵袭实验。结果显示，经0.1、0.2 μmol/L PI-103作用后穿过小室的A375细胞数量减少，提示PI-103可以降低A375细胞的迁移力和侵袭力。
肿瘤细胞的迁移和侵袭是一个多步骤、多阶段的复杂过程，细胞基底膜及细胞外基质的降解突破是其中重要的环节之一。MMPs是基底膜及细胞外基质降解的主要蛋白水解酶，其中MMP-2、MMP-9是MMPs家族中的重要成员，能有效降解基底膜的主要成分Ⅳ型胶原和层粘连蛋白，其表达水平与肿瘤细胞的侵袭转移密切相关[15]。有研究表明，PI3K可通过活化Akt激活黑色素瘤细胞磷脂蛋白2，进而促进MMP-2的表达[16]。大量研究证实，黑色素瘤细胞MMP-2、MMP-9的表达水平与其侵袭力呈正相关，抑制MMP-2、MMP-9的表达能抑制黑素瘤细胞的侵袭和转移[17-18]。本研究显示，PI-103在体外可抑制A375细胞MMP-2、MMP-9的表达，由此推测PI-103可能是通过竞争性抑制黑色素瘤细胞PI3K/mTOR，阻断Pl3K/Akt/mTOR信号通路，下调MMP-2、MMP-9的表达，进而抑制其迁移和侵袭。
综上所述，PI3K/mTOR双重抑制剂PI-103在体外可抑制A375细胞迁移和侵袭，其机制可能与下调MMP-2、MMP-9的表达有关，这显示了它在恶性黑素瘤治疗中的潜在应用价值，为其应用于抗恶性黑素瘤转移治疗提供了初步的实验依据。
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（收稿日期：2014-05-23 本文编辑：程 铭）